使用E-钙粘蛋白结合型核酸适配体的细胞支架材料制造技术

本发明专利技术提供使用了核酸适配体的细胞培养用支架材料，所述核酸适配体是能够化学合成、不含动物来源成分、生物相容性高的材料。细胞支架材料，其含有E‑钙粘蛋白结合型核酸适配体。

Cell scaffolds using E-cadherin binding aptamers

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用E-钙粘蛋白结合型核酸适配体的细胞支架材料
本专利技术细胞涉及细胞支架材料，其含有能够与作为细胞粘附因子的E-钙粘蛋白(E-cadherin)特异性结合的核酸。
技术介绍
细胞的增殖、生理功能、分化能力根据存在于细胞表面的粘附蛋白与其配体的结合而变化是已知的(非专利文献1)。因此，若能够获得与细胞表面蛋白质牢固地结合的、可进行化学修饰的分子组，向细胞提供非天然型的高度结合方式，则可期待构建能够不导入基因而安全且简便地改善细胞功能的新方法理论。细胞的功能受到培养环境很大影响是已知的。其中，细胞与基材表面的粘附、以及细胞之间的粘附会大大影响细胞的增殖、分化。例如，为了向基材表面赋予细胞粘附能力，实施了用纤连蛋白、胶原蛋白等蛋白质、以及作为纤连蛋白的整合素结合位点的RGD肽对基材表面进行修饰等手段。近年来，为了在单层状态下维持干细胞的分化能力，提出了利用固定化有E-钙粘蛋白的基材表面的方案。使用明胶包被板或支承细胞层(饲养细胞层)培养的ES细胞通过介由E-钙粘蛋白的细胞-细胞粘附(Cell-Celladhesion)而形成紧密凝聚的集落(非专利文献2)。长冈等人发现，在用E-钙粘蛋白与免疫球蛋白(IgG)的Fc结构域形成的融合蛋白(ECad-Fc)包被的板上培养小鼠的ES细胞时，细胞间不接触，不形成集落。如此培养的细胞在长期培养后仍然维持用于分化成全部三种胚层细胞的多分化能力、和包括种系传递在内的全部ES细胞功能，具有比形成集落的状态更高的增殖能力(非专利文献3)。一般而言，使用动物来源成分进行细胞培养。通常，培养用培养基成分中含有5～10％左右的血清，进而，为了提高存活率、增殖率、分化，添加特定种类的蛋白质。这些血清、蛋白质成分为动物来源成分。另外，被期待作为再生医疗、药效、毒性评价等的工具利用的人多能干(iPS)细胞(非专利文献4)是利用作为饲养细胞的来自小鼠胚胎的成纤维细胞、或基质胶(Matrigel)(来自小鼠肉瘤的基底膜基质)等源于动物成分的的支架材料培养的(非专利文献5)。这些培养中利用了细胞-基质粘附(cell-substratumadhesion)，而非细胞-细胞粘附。上述人iPS细胞用支架材料包含各种不确定因素，因此，不仅担心临床应用中的安全性，而且由于含有许多动物来源成分故而需要考虑制造商、批次之间的重现性。另外，为了维持人iPS细胞的未分化、阐明分化中的分子机制，也期望构建不含不确定因素的、全部由已知组成构成的非动物来源成分(Xeno-free(无异源))的支架材料。核酸适配体是具有分子识别能力的单链DNA/RNA，鉴于其结构多样性，已经报道了大量与小分子、蛋白质、细胞等各种靶标具有高结合能力的核酸适配体，作为替代抗体的新型分子识别元件而受到关注(非专利文献6)。核酸适配体是具有能够在不利用生物的情况下筛选、能够向任意部位导入化学修饰、可容易进行核酸适配体之间的连接、热稳定性及保存性高等抗体所不具有的诸多特长的生物体高分子。核酸适配体是能够化学合成、不含动物来源成分、且生物相容性高的材料。鉴于上述特征，通过将核酸适配体作为非动物来源成分(Xeno-free)的支架材料，能够确保在生物体外培养的细胞、组织的均匀性，同时可安全地利用。例如，认为能够解决现有的人iPS细胞培养用支架材料的问题点，即对于临床应用中安全性的担心、由制造商或批次间导致的重现性的降低。另外，就利用了核酸适配体的支架材料而言，可期待能够通过核酸酶处理在不对细胞表面蛋白质造成损伤的情况下系统性地回收培养细胞。另一方面，迄今为止报道了多种与各种靶标结合的核酸适配体，但并未报道核酸适配体单体诱导细胞粘附、及作为支架材料应用的例子。与蛋白质、细胞特异性结合的新型适配体的探索中，使用了试管内进化法(体外筛选法)作为最有效的手段。尤其是SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment(指数富集配体系统进化))法中，大致区分的话，有目标核酸分子的筛选、和筛选出的适配体的扩增这2个步骤(例如，专利文献1)。通过在提高选择压的同时重复进行该筛选和扩增，能够得到具有高亲和性的核酸片段。此外，近年来报道了施加各种改良、能够以更少的循环次数回收适配体、在效率·选择性方面优异的方法等。这些适配体具备对于靶标的高亲和性、特异性(这也是以往诊断、治疗中使用的抗体的特性)自不必说，并且还具备抗体所不具有的各种优点，即，能够在短时间内化学合成，而且还能够廉价地进行分子修饰，结构简单，且几乎没有免疫原性。对于包含序列号1的碱基序列的核酸，报道了其高级结构和与E-钙粘蛋白-Fc融合蛋白结合的能力(非专利文献8)。但是，与细胞粘附的关联并不为人所知。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开WO91/19813号公报非专利文献非专利文献1：Albelda，S.M.等，TheFasebJ.1990，4，2868-2880.非专利文献2：Larue，L.等，Development1996，122，3185-3194.非专利文献3：Nagaoka，M.等，PLoSONE2006，e15，1-7.非专利文献4：Takahashi，K.等，Cell，2007，131，861-872.非专利文献5：Xu，C.等，Nat.Biotechnol.，2001，19，971-974.非专利文献6：Yang，L.等，Adv.DrugDeliv.Rev.2011，63，1361-1370.非专利文献7：Jellinek等，1994，Biochemistry33，10450非专利文献8：第75次分析化学讨论会演讲主旨集(第75回分析化学討論会講演要旨集)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题在上述背景之下，本专利技术的课题在于提供使用经核酸适配体修饰的基材来直接诱导细胞粘附的功能性支架材料，所述核酸适配体是能够化学合成、不含动物来源成分、且保存性和生物相容性高的材料。用于解决课题的手段本申请专利技术人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果利用使用了磁性微粒的SELEX法确定了具有与作为细胞粘附因子之一的E-钙粘蛋白特异性结合的能力的核苷酸序列，发现具有该特定序列的核酸能够作为相对于E-钙粘蛋白而言的特异性适配体发挥作用，进而发现，经该适配体修饰的表面可直接诱导细胞粘附，从而完成了本专利技术。即，本专利技术在一个方式中提供使核酸适配体吸附于基板而形成的细胞支架材料，所述核酸适配体包含序列号1所示的核酸序列，且与E-钙粘蛋白特异性结合。此处，这些适配体为RNA的情况下，序列号1的碱基序列中T(胸腺嘧啶)为U(尿嘧啶)。本专利技术的优选方式中，为了便于检测，也可在上述核酸适配体的5’末端或3’末端与引物识别序列、荧光标记进行连接，另外，为了对基材表面进行修饰，也可在上述核酸适配体的5’末端或3’末端与氨基、羧基、乙烯基、生物素、抗生物素蛋白或链霉亲和素或者其他特异性结合标签肽进行连接。另外，本专利技术也涉及用于细胞培养的支承体的制备方法，其中，使用含有E-钙粘蛋白结合型核酸适配体的细胞支架材料对支承体的表面进行修饰。优选的是，E-钙粘蛋白结合型DNA适配体为包含序列号1所示的碱基序列的核酸。E-钙粘蛋白结合型DNA适配体可含有选自由糖链部分中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细胞支架材料，其含有E‑钙粘蛋白结合型核酸适配体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.22 JP 2016-1618071.细胞支架材料，其含有E-钙粘蛋白结合型核酸适配体。2.如权利要求1所述的细胞支架材料，其中，E-钙粘蛋白结合型核酸适配体为包含序列号1所示的碱基序列的核酸。3.用于细胞培养的支承体，其利用权利要求1或权利要求2所述的细胞支架材料对表面进行了修饰。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：古性均，吉本敬太郎，丸山亮，
申请(专利权)人：日产化学株式会社，国立大学法人东京大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP