一种消化RPE细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种消化RPE细胞以解除其细胞贴壁状态的方法，包括以下步骤：(1)使用1×TrypLE select，使其均匀覆盖于RPE细胞；(2)使用Dispase II溶液，使其均匀覆盖于RPE细胞，其中步骤(1)和(2)是分步实施。

A Method of Digesting RPE Cells

【技术实现步骤摘要】
一种消化RPE细胞的方法
本专利技术总体上涉及生命科学领域，具体涉及一种RPE细胞解除贴壁状态的消化方法。
技术介绍
视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium，简称RPE)是由单层色素上皮细胞所构成，排列十分规则。细胞呈多角形，细胞分为三部分，即顶部、体部和基底部。RPE是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其筛子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞的OS；促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜-血管屏障等。老年性黄斑变性亦称年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，简称AMD)。大多始发于50岁上下，年龄越大，患病率越高。发病与性别、种族无明显关系。双眼同时或先后受害。AMD的症状和诊断主要症状是中心视力下降，视野中心有黑影遮挡，及视物会变形。由于本病原因还不明确，所致至今尚无有效治疗和根本性的预防措施。AMD主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排除沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分为干性和湿性两种，其中，干性AMD更为常见，他是由于RPE进行性营养不良造成的脉络膜毛细血管和光受体缺失的一种疾病。湿性AMD的典型特征是有脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)生成，从而造成严重的视力丧失。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并回复视力的有效办法。RPE细胞治疗AMD的试验显示通过在视网膜下腔移植正常RPE细胞，能够延缓进行性的视觉功能丧失。RPE细胞移植在RPE遗传缺陷动物模型和AMD病人上的试验，都显示能够延缓视网膜的退行性病变，改善视觉功能。所以RPE细胞在不久的将来有望成为干细胞药物，但是由于RPE细胞本身的特殊性，成为干细胞药物要克服生产工艺上的两大难点，其中之一是RPE细胞解除贴壁状态的方法。本专利的消化方法旨在于解决此问题。
技术实现思路
本专利技术一方面公开了一种消化酶组合物，包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII，使用所述酶组合物可以解除RPE细胞的贴壁状态。其中在一个实施例中，重组酶TrypLE优选为1×TrypLEselect。在另一个实施例中，中性蛋白酶DispaseII的浓度选自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，优选选自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，更优选为2.0mg/mL。另一方面，本专利技术公开了一种消化酶组合物在制备用于解除RPE细胞贴壁状态的试剂或试剂盒中的应用，其中所述消化酶组合物包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII。另一方面，本专利技术也公开了一种消化酶组合物在解除RPE细胞贴壁状态的用途，其中，所述消化酶组合物包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII。在一个实施例中，所述中性蛋白酶DispaseII的浓度选自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，优选选自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，更优选为2.0mg/mL。另一方面，本专利技术还公开了一种消化RPE细胞以解除其细胞贴壁状态的方法，包括以下步骤：(1)使用1×重组酶TrypLE，使其均匀覆盖于RPE细胞；和(2)使用中性蛋白酶DispaseII溶液，使其均匀覆盖于RPE细胞；其中步骤(1)和(2)可以分步实施。其中，所述中性蛋白酶DispaseII的浓度选自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，优选选自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，更优选为2.0mg/mL。在一个具体实施例中，所述RPE细胞为培养15天至17天中任一时间点的细胞。在一个具体实施例中，在所述步骤(1)中所述重组酶TrypLE处理RPE细胞的条件为37℃温育14至16分钟。在一个具体实施例中，在所述步骤(2)中，所述中性蛋白酶DispaseII处理RPE细胞的条件为37℃温育10至15分钟。如前任一项所述的方法，其步骤还包括：在所述步骤(1)或(2)之前用无钙镁离子的DPBS清洗细胞并弃掉清洗液。在一个具体实施例中，本专利技术中使用的DPBS或重组酶TrypLE在使用之前，需要置于37℃恒温水浴锅中预热5至10分钟。在一个具体实施例中，消化结束后弃掉中性蛋白酶DispaseII溶液，轻轻吹打使细胞脱落，收集细胞，补加RPE完全培养基，以2000rpm，5分钟离心后尽弃上清。在一个具体实施例中，RPE细胞培养在T25培养瓶中。在一个具体实施例中，中性蛋白酶DispaseII溶液配制如下：-20℃取出中性蛋白酶DispaseII母液，母液浓度为40mg/mL，母液融化后根据细胞状态加入DPBS(无钙镁离子)配制适宜浓度的中性蛋白酶DispaseII溶液，推荐配制后中性蛋白酶DispaseII溶液的浓度为2.0-4.0mg/mL，即酶活力为1.5-2.4IU/mL。在本专利技术中，RPE细胞可以是任何眼组织分离纯化得到的各个培养代次的RPE细胞，优选P2代。有益效果提供一种简单易操作的人类视网膜色素上皮细胞解除贴壁状态的方法，为RPE细胞体外培养、扩增RPE细胞和纯化提供了有力支撑，为治疗AMD等RPE损伤疾病提供了新来源；具体优势如下：1、重组酶TrypLE相对胰酶比较温和，对工艺而言可控性更强；2、重组酶TrypLE+中性蛋白酶DispaseII组冻存后细胞的贴壁率显著高于胰酶+中性蛋白酶DispaseII组，且具有协同效应，效果远远优于单独使用重组酶TrypLE、胰酶、或中性蛋白酶DispaseII；3、重组酶TrypLE+中性蛋白酶DispaseII作为无动物源的消化液，更具安全性。附图说明图1示出本专利技术一具体实施例的实验流程图。图2示出不同浓度消化液消化计数结果。图3示出不同浓度消化酶消化后细胞活率。图4示出不同浓度消化酶消化后细胞活率。图5示出细胞消化前后的照片。图6示出细胞经过TrypLE+DispaseII组和胰酶+DispaseII组消化后的细胞数量及活率统计。图7示出细胞经过TrypLE+DispaseII组和胰酶+DispaseII组消化冻存后的贴壁率统计。图8示出RPE细胞只经过TrypLE消化后的细胞图像。图9示出RPE细胞只经过DispaseII消化后的细胞图像。具体实施方式通过以下实施例进一步说明本专利技术。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本专利技术的范围或内容。除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解相同的含义。如本文所述，术语“TrypLE”、“重组酶TrypLE”、“Tryple”可互换。如本文所述，术语“DispaseII”、“中性蛋白酶II”、“分散酶II”可互换，其是指一种非特异性的金属基质蛋白酶。如本文所述，术语“贴壁率”是指相同数量细胞经过消化后冻存、复苏离心后，将相同数目的经过离心沉淀活细胞铺板培养，能够贴壁并存活的细胞百分率，因此本专利技术中所用的贴壁率体现了细胞经冻存后的细胞活力。回收率是复苏细胞洗涤后重新本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种消化酶组合物，包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶Dispase II，其中，使用所述酶组合物可以解除RPE细胞的贴壁状态。

【技术特征摘要】
1.一种消化酶组合物，包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII，其中，使用所述酶组合物可以解除RPE细胞的贴壁状态。2.一种消化酶组合物在制备用于解除RPE细胞贴壁状态的试剂或试剂盒中的应用，其中，所述消化酶组合物包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII。3.一种消化酶组合物在解除RPE细胞贴壁状态的用途，其中，所述消化酶组合物包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII。4.如权利要求1至3中任一项所述的应用或如权利要求3所述的用途，其中，所述中性蛋白酶DispaseII的浓度选自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，优选选自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度。5.一种消化RPE细胞以解除其细胞贴壁状态的方法，包括以下步骤：(1)使用1×重组酶TrypLE，使其均匀覆盖于RPE细胞；和(2)使用中性蛋白酶DispaseII溶液，使其均匀覆盖于RPE细胞；其中步骤(1)和(2)是分步实施。6.如权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：范国平，闫占海，方攀峰，李宁，谢磊，
申请(专利权)人：江苏艾尔康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32