一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法技术

本发明专利技术涉及一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，具体步骤包括：(1)对脑脊液进行预处理；(2)加入PE标记的一抗进行分选；(3)加入免疫磁珠；(4)增加磁场，进行分离。与现有技术相比，本发明专利技术精准分离中枢神经系统不同细胞来源的外泌体亚群，可供针对性的对中枢疾病以及不同靶细胞外泌体深入研究。

【技术实现步骤摘要】
一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法
本专利技术涉及一种分离纯化方法，尤其是涉及一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法。
技术介绍
免疫磁珠法分离外泌体是基于外泌体表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的外泌体被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的外泌体由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使表达特定标志物的外泌体亚型得以分离。外泌体是一种由细胞主动分泌到胞外的囊泡小体，直径为30-100nm，携带有来源细胞的多种蛋白和RNA成分，可作为细胞间信息交流和物质传递的媒介。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位，星形胶质细胞是中枢数量最多、承担重要的代谢和支持功能的细胞，小胶质细胞是中枢最重要的免疫细胞，可被多种刺激和疾病状态激活。神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞是中枢系统三种主要的细胞，均可产生外泌体，释放入脑脊液或者血液。外泌体是具有生物活性的微囊泡，可被周围细胞摄取，进行细胞间物质传递和信息交流。近年来研究发现，多种中枢疾病发病过程中外泌体参与中枢疾病的进程，比如脑内炎症性疾病，小胶质细胞激活后大量释放的外泌体参与疾病进展；神经退行性疾病中，比如阿尔兹海默病，神经元细胞释放内含有参与异常蛋白a-β的多聚体的外泌体，并参与a-β的传播。因此，脑脊液中不同细胞来源的外泌体的表达分泌情况可作为中枢疾病评估的依据。目前，脑脊液外泌体分离主要有超速离心法，梯度密度离心法，超滤法，层析法，大分子聚合物沉降法，免疫磁珠试剂盒法等。超速离心法要求样品体积大(mL-L级别)，虽然对外泌体得率较高，但耗时耗力(超过2小时)。市面上常用的外泌体分离试剂原理为大分子聚合物沉淀法，提取外泌体耗时短，但缺点是产物外泌体纯度低，掺杂混杂蛋白和盐份。超滤法只能将直径小于滤膜孔径的囊泡分离出来，也会导致产物不纯。更重要的是，以上所述技术均只能分离脑脊液中的总外泌体，无法对特定亚群的外泌体(比如小胶质细胞来源的CD11b+外泌体)的分离，当然也就无法实现使用特定细胞来源外泌体亚群反映疾病程度的目的。在精准医学不断发展的今天，根据不同细胞来源对外泌体进行精准分型成为迫切需要解决的问题，这一要求，也是外泌体液体活检开发进步以及应用于临床的第一步。免疫磁珠捕获可对特定表达某种标志物蛋白的外泌体进行结合，经洗脱后可以准确区分外泌体亚型和细胞来源。但该项技术目前仍然不成熟，目前没有可以直接应用于脑脊液的外泌体亚型分选磁珠。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，目的在于提供一种操作简单快速且成本较低，能精准分离中枢主要的三种细胞来源(特异性表达小胶质细胞CD11b+、神经元Neun、星形胶质细胞GFAP)外泌体分离方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，包括以下步骤：(1)将脑脊液离心分离，去除细胞碎片等杂质，取上清加入外泌体沉降抽提试剂后，混匀，孵育过夜，离心去掉上清液后，重悬，得到脑脊液样本；(2)在步骤(1)得到的脑脊液样本中加入PE标记的一抗，孵育后，加入外泌体分选试剂，混匀孵育，得到脑脊液标记样本；(3)将PE包被的磁珠震荡混匀，加入步骤(2)得到的脑脊液标记样本，混匀后孵育，得到混合样本；(4)将混合样本洗涤、吹打、置于磁场中，翻转后弃掉上清液；(5)重复步骤(4)后，将沉淀洗涤，加入外泌体解离液，混匀孵育，然后洗涤、吹打、置于磁场中，翻转后收集上清液，即为特定来源的外泌体。优选的，步骤(1)中：脑脊液和外泌体沉降抽提试剂的体积比为5:1。优选的，步骤(1)中：重悬采用PBS或蒸馏水，终体积为250μL-1mL。优选的，步骤(2)中：PE标记的一抗为PE标记的CD11b、Neun或GFAP一抗。优选的，步骤(2)中：加入PE标记的一抗后，样本的浓度为0.2-2μg/mL。优选的，步骤(2)中：每毫升脑脊液样本加入25-100μL外泌体分选试剂。优选的，步骤(3)中：每毫升脑脊液标记样本加入100μL磁珠。优选的，步骤(4)中：洗涤液成分为D-PBS(杜氏磷酸盐缓冲液)+0.2％无外泌体血清+1mMEDTA(乙二胺四乙酸)。优选的，步骤(4)中：将样品放入磁力架内，拿起磁铁，整体翻转，倒掉上清液。优选的，步骤(5)中：每毫升样本加入外泌体解离液的体积≥100μL。目前针对人体生物样本(尿液、血液、唾液、腹水、胸腹水等)外泌体的分离和分析，都无法准确区分外泌体的细胞来源，所以只能分析多种来源外泌体的混合样本。这种混合样本无法满足精准医学的需求，更无法从着眼于不同细胞承担不同功能、发挥不同作用的角度来精确研究。本专利技术提供一种可行的、快速简便的不同细胞来源外泌体分离的方法。本专利技术为用于诊断目的的潜在效用，需要测试临床样本，本专利技术的分离方法可推广至各种体液(尿液、血液、唾液、腹水、胸腹水等)以及细胞培养液中外泌体的细胞来源亚群分离。本专利技术通过简单的常规离心操作结合细胞特异性抗体把体液中不同细胞来源的外泌体从混杂的总外泌体中分离出来，并保持生物学活性。我们的技术潜在的应用就是在外泌体液体活检，发现特种细胞来源外泌体的生物标志物，从而为预测治疗反应和疾病进展提供依据。本专利技术每次只需要通过普通离心条件结合现有的应用于细胞层面的抗体，就可以完成不同细胞来源外泌体的分离过程。分离过程中无需超速离心机，每次可以同时提取多个样品，大大简化操作规程，节约成本，使外泌体的精准分型和开发外泌体的体液活检大大方便成为可能，提取的外泌体保持其本身生物学活性。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、提供快速便利的分离方法，精准分离中枢神经系统不同细胞来源的外泌体亚群，可供针对性的对中枢疾病以及不同靶细胞外泌体深入研究；2、获得的外泌体纯度高，体现在所携带的标志物单一、杂质囊泡少，有利于在研究中获得证据级别更好的结果。附图说明图1为WesternBlot检测外泌体特异性标记物Alix和Tsg101；图2为快速免疫磁珠法分离脑脊液中小胶质细胞来源外泌体的普通投射电镜效果图；图3为快速免疫磁珠法分离脑脊液中小胶质细胞来源CD11b+外泌体的纳米流式检测结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1实施例中使用的主要仪器及试剂：外泌体沉降抽提试剂(EXOTC50A-1，SBIsystembiosciences，美国)；PE-anti-CD11b抗体(eBioscience，4290075)；PE包被的磁珠分选试剂盒(#17654，EasySep，美国)；无外泌体血清(EXOFBS50A-1，ExoPerfect，中国)；电子显微镜(phillipCM120，日本)；磁力架(EasySep，美国)；离心管(corning，美国)。快速免疫磁珠法分离脑脊液中小胶质细胞来源(CD11b+)外泌体亚群，具体步骤如下：(1)取出-80℃冻存的脑脊液，冰上融化，吸取2毫升脑脊液，置于4℃预冷的离心机，经3000g*15分钟离心分离，去除细胞碎片等杂质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将脑脊液离心分离，取上清加入外泌体沉降抽提试剂后，混匀，孵育过夜，离心去掉上清液后，重悬，得到脑脊液样本；(2)在步骤(1)得到的脑脊液样本中加入PE标记的一抗，孵育后，加入外泌体分选试剂，混匀孵育，得到脑脊液标记样本；(3)将PE包被的磁珠震荡混匀，加入步骤(2)得到的脑脊液标记样本，混匀后孵育，得到混合样本；(4)将混合样本洗涤、吹打、置于磁场中，翻转后弃掉上清液；(5)将步骤(4)得到的沉淀洗涤，加入外泌体解离液，混匀孵育，然后洗涤、吹打、置于磁场中，翻转后收集上清液，即为特定来源的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将脑脊液离心分离，取上清加入外泌体沉降抽提试剂后，混匀，孵育过夜，离心去掉上清液后，重悬，得到脑脊液样本；(2)在步骤(1)得到的脑脊液样本中加入PE标记的一抗，孵育后，加入外泌体分选试剂，混匀孵育，得到脑脊液标记样本；(3)将PE包被的磁珠震荡混匀，加入步骤(2)得到的脑脊液标记样本，混匀后孵育，得到混合样本；(4)将混合样本洗涤、吹打、置于磁场中，翻转后弃掉上清液；(5)将步骤(4)得到的沉淀洗涤，加入外泌体解离液，混匀孵育，然后洗涤、吹打、置于磁场中，翻转后收集上清液，即为特定来源的外泌体。2.根据权利要求1所述的一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，其特征在于，步骤(1)中：脑脊液和外泌体沉降抽提试剂的体积比为5:1。3.根据权利要求1所述的一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，其特征在于，步骤(1)中：重悬采用PBS或蒸馏水。4.根据权利要求1所述的一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，其特征在于，步骤(2)中：PE标记的一抗为PE标...

【专利技术属性】
技术研发人员：董强，崔梅，国敏，陈兴栋，赵鸿琛，丁梦媛，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31