水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用技术

本申请公开了一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2‑Lys47的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2‑Lys47的方法，所述方法采用膜技术及一次柱层析技术，从而获得高纯度的水蛭素突变体HV2‑Lys47。本申请还公开了由此制备的水蛭素突变体HV2‑Lys47在抗凝采血管中的应用及包含水蛭素突变体HV2‑Lys47的抗凝采血管。

Extraction and Purification of Hirudin Mutant and Its Application

【技术实现步骤摘要】
水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用
本申请涉及生物工程技术，尤指从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47(SEQIDNO.:1)的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，及由此得到的纯化的水蛭素突变体HV2-Lys47。本申请还涉及生物医疗器械，尤指由上述方法纯化制得的水蛭素突变体HV2-Lys47在抗凝采血管中的应用。
技术介绍
天然水蛭素(Hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中已提取出的多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。水蛭含有丰富的水蛭素，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，归因于可促进肿瘤中的血流而使疗效增强。由于天然水蛭素产能较低，临床应该量大，国内外开展了大量重组水蛭素研究，自上个世纪八十年代末研制出与天然水蛭素结构相似、作用相同的重组水蛭素，产能大。然而，现有蛋白和肽类的纯化基本都需要两种或三种以上的多次层析分离才能拿到纯品，并且洗脱剂包含大量的水和盐，对环境污染大，污水处理工程压力大。目前市场所用的水蛭素突变体的抗凝活性为16000ATU/mg，纯度为93％左右。比如，陈华友等(安徽农业科学，2009年，37(34)；第16757-16759页及第16768页)公开了发酵液经离心、三氯乙酸处理、超滤浓缩脱盐，再上阴离子交换柱，S100分子筛柱，最后得到95％的纯品；韦利军等人(2004年全国生物技术学术研讨会论文集，第104-112页)公开了使用大孔树脂层析、DEAE层析、反相色谱层析的三次层析法分离得到95％纯品。其中，层析步骤越多，成本越高且越费时，环境污染也越高。因此，存在对工艺简洁、废水少、适合工业放大的水蛭素突变体HV2-Lys47的提取纯化方法的需求。此外，血液标本的采集和分离在临床生化检测中至关重要，是保证质量的一个重要环节。传统的标本采集从开始采血到血清析出上机检测，往往需要较长时间，使全自动生化分析仪的高效性受到限制。部分生化实验室使用肝素抗凝血浆，取血后可以立即离心分离出血浆上机检测，但无论肝素钠还是肝素锂抗凝血浆，对某些生化指标都会产生影响。1997年我国开始推广真空采血技术，是对传统采血方式的一次重大改进。由于是在全封闭系统下完成采血程序，因而从根本上排除了血液污染和交叉感染的可能性，采血更安全、更准确、更规范，因而易于普及和推广。在真空采血管内可加入分离胶、促凝剂，以及各种抗凝剂，以管帽的颜色来区分不同用途的采血管。近年来，含促凝剂和分离胶的真空采血管在生化检验被广泛使用，它大大缩短了血液凝固的时间，一般放置20min后就可进行离心分离出血清，但有一定比例的采血管离心效果不佳，血清中存在蛋白凝丝或凝块。分离胶是一种由数种化合物组成的半固体惰性胶，不影响血清各成份的含量，但促凝管因促凝剂的原料产地、性质、制作工艺不同，可能对生化检测造成不同的影响。天然水蛭素是从吸血水蛭(俗称蚂蟥)的唾液腺中提取、分离得到的一种多肽，是水蛭体内的重要活性成分，但产量极其有限，不能满足临床应用的要求。因此，存在抗凝活性更佳的、来源更稳定的抗凝剂需求。
技术实现思路
本申请提供了一种工艺简洁、废水少、适合工业放大的水蛭素突变体HV2-Lys47的提取纯化方法。为了达到本申请目的，本申请提供了一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47(SEQIDNO.:1)的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，所述方法包括：在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液，以灭菌且去除杂蛋白；通过陶瓷膜或通过离心机来处理灭菌的发酵液，以去除菌体；可选地，通过超滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液，以去除杂蛋白；通过纳滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液、或通过超滤膜的发酵液，以获得粗分离的浓缩液；将盐添加到所述粗分离的浓缩液中作为辅料，喷雾干燥，得到干粉；将所述干粉溶解在水中并滤除杂质，可选地通过滤纸、砂芯漏斗或膜设备来进行过滤；使滤液仅通过分子筛柱层析1次，用水洗脱，浓缩收集液，得到水蛭素突变体HV2-Lys47粗品；将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品。在以上或其他实施方式中，升高的温度可以是能够灭菌的高温，比如65℃的温度等。在以上或其他实施方式中，所述干燥可以为真空干燥。在以上或其他实施方式中，所述干燥可以为冷冻真空干燥。在以上或其他实施方式中，通过离心机来处理灭菌的发酵液。在以上或其他实施方式中，离心机可以为管式离心机或碟式离心机。其中，陶瓷膜处理或离心机处理的目的是为了去除菌体，超滤膜处理的目的是去除杂蛋白，且纳滤膜处理的目的是进行浓缩。在以上或其他实施方式中，所述高温处理可以是在65℃-67℃下保持5-20分钟，可选地保持10分钟。在以上或其他实施方式中，所述盐可以选自氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠或硫酸钾中的一种或多种。在以上或其他实施方式中，所述分子筛柱层析可以选自由sephadexG25、sephadexG50、sephadexG75和sephadexG100组成的组。本领域技术人员将理解的是，上述这些分子筛柱层析均为市售产品。其中，使用分子筛柱层析的目的主要是除去色素、盐及分子量离水蛭素较远的多肽和多糖。在以上或其他实施方式中，经由分子筛柱层析得到的收集液的浓缩可以通过减压真空浓缩、纳滤膜浓缩或反渗透膜浓缩来进行。在以上或其他实施方式中，所述有机溶剂可以选自乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙腈中的一种或更多种。在以上或其他实施方式中，作为辅料添加的盐的以克计的重量为基于粗分离的浓缩液的以毫升计的体积的5％或更大，可选地10％或更大。本申请的专利技术人发现，如上以重量体积分数5％或更大的量添加盐就可以达到本申请的纯化目的，加盐少于5％水蛭素损失大，而加盐过多成本过高。在以上或其他实施方式中，用于溶解所述干粉的水的以毫升计的体积为所述干粉的以克计的重量的10倍以上。其中，选择用一定量的水来溶解干粉的目的是为了保持盐的以克计的重量为基于水溶液的以毫升计的体积的5％或更小，从而使得不溶于水的部分杂蛋白可以通过过滤除去。在以上或其他实施方式中，为了使水蛭素突变体HV2-Lys47沉淀，所添加的盐的以克计的重量为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的以毫升计的体积的20％-30％，所添加的有机溶剂的体积为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的体积的5-9倍。其中，使重组水蛭素重新沉淀出的步骤是为了除去分子量离水蛭素较近的多糖和多肽。在以上或其他实施方式中，所述大肠杆菌发酵液可以是通过以pB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2‑Lys47(SEQ ID NO.:1)的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2‑Lys47的方法，包括以下步骤：在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液，以灭菌且去除杂蛋白；通过陶瓷膜或通过离心机来处理灭菌的发酵液，以去除菌体；可选地，通过超滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液，以去除杂蛋白；通过纳滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液、或通过超滤膜的发酵液，以获得粗分离的浓缩液；将盐添加到所述粗分离的浓缩液中作为辅料，喷雾干燥，得到干粉；将所述干粉溶解在水中并过滤除杂，可选地通过滤纸、砂芯漏斗或膜设备来进行过滤；使滤液仅通过分子筛柱层析1次，用水洗脱，浓缩收集液，得到水蛭素突变体HV2‑Lys47粗品；将所述水蛭素突变体HV2‑Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2‑Lys47，干燥即得水蛭素突变体HV2‑Lys47纯品，可选地进行真空干燥，更可选地进行冷冻真空干燥。

【技术特征摘要】
1.一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47(SEQIDNO.:1)的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，包括以下步骤：在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液，以灭菌且去除杂蛋白；通过陶瓷膜或通过离心机来处理灭菌的发酵液，以去除菌体；可选地，通过超滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液，以去除杂蛋白；通过纳滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液、或通过超滤膜的发酵液，以获得粗分离的浓缩液；将盐添加到所述粗分离的浓缩液中作为辅料，喷雾干燥，得到干粉；将所述干粉溶解在水中并过滤除杂，可选地通过滤纸、砂芯漏斗或膜设备来进行过滤；使滤液仅通过分子筛柱层析1次，用水洗脱，浓缩收集液，得到水蛭素突变体HV2-Lys47粗品；将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品，可选地进行真空干燥，更可选地进行冷冻真空干燥。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过离心机来处理高温灭菌的发酵液，可选地所述离心机为管式离心机或碟式离心机。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高温处理是在65℃-67℃下保持5-20分钟，可选地10分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾中的一种或更多种。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子筛柱层析选自由sephadexG25、sephadexG50、sephadexG75和sephadexG100组成的组。6.根据权利要求1所述的方法，其中，浓缩经由分子筛柱层析得到的收集液是通过减压真空浓缩、纳滤膜浓缩或反渗透膜浓缩来进行的。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙腈中的一种或更多种。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，作为辅料添加的盐的以克计的重量为粗分离的浓缩液的以毫升计的体积的5％或更大。9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，用于溶解所述干粉的水的以毫升计的体积为所述干粉的以克计的重量的10倍以上。10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，为了使水蛭素突变体HV2-Lys47沉淀，所添加的盐的以克计的重量为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的以毫升计的体积的20％-30％，所添加的有机溶剂的体积为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的体积的5-9倍。11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述大肠杆菌发酵液是通...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈杰鹏，段丽丽，陈鸿锐，胡留松，陈煜藩，洪琳，许志锴，叶红林，纪烨瑜，蔡春丽，
申请(专利权)人：广东双骏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44