森林山蛭抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种森林山蛭(Haemadipsa sylvestris)抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用，属于生物医学技术领域。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，等电点6.28。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的基因，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。本发明专利技术森林山蛭抗血栓肽Sylvestin能够抑制FXIIa和kallikrein，有极显著的抗血栓和抑制急性脑出血的作用；该抗血栓肽具有结构简单、人工合成方便、抗血栓活性强，能作为制备FXIIa、kallikrein抑制剂和抗血栓和抑制急性脑出血药物应用。

【技术实现步骤摘要】
森林山蛭抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种森林山蛭(Haemadipsasylvestris)抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用。
技术介绍
脑血管疾病是导致我国中老年人死亡的主要病因之一，也是世界性卫生战略研究重点之一。在脑血管疾病中，急性缺血性疾病的发病率居于首位，具有致残率高、死亡率高和复发率高的特点。全球脑卒中病死逾150万例/年，随着老年人口的增加呈逐年增长的趋势，严重威胁着人类生命健康和生活质量。因此，研究治疗急性脑缺血的药物具有巨大的社会需求和重要的社会意义。急性脑缺血的主要病因是脑血管栓塞，这是由于脑血管中血栓形成导致血流不畅，进而造成血管梗死的结果。治疗急性脑缺血的关键措施之一是解除血管栓塞，恢复缺血区血液供应。因此，溶栓治疗成为临床治疗急性脑缺血的关键环节。溶栓药物的应用被临床证明能有效解除脑缺血，成为治疗急性脑缺血的主要方向。目前被美国FDA批准的抗脑缺血药物只有t-PA(组织型纤溶酶原激活物)一种，但该药仅在发病3h有效。t-PA的作用靶点是纤溶酶原，会导致较高的出血发生率。以FXIIa(激活型凝血酶原十二因子)和kallikrein(激肽释放酶)为作用靶点的药物出血倾向非常低，因此以它们为作用靶点，研究和开发新型药效好、副作用低的治疗抗血栓药物，具有良好的社会经济效益和市场前景。蛭类是我国的一种传统中药，两千多年前的《神农本草经》中就有描述。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。森林山蛭(Haemadipsasylvestris)，又称草蛭。蛭纲,水蛭科。体略呈长椭圆形，长约3厘米。该物种的模式产地在缅甸长林山。分布于印度尼西亚、缅甸、印度、越南以及中国大陆的云南等地。主要栖息于潮湿的山区草地或竹林里以及水附近或水中。当人畜经过时，就附着吸食血液。山蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能。因此被山蛭咬过的伤口常流血不止。民间也利用这一性质，用山蛭来治疗病人的局部血流不畅。我们首次从森林山蛭中识别了一个作用很强的FXIIa和kallikrein抑制剂Sylvestin。本专利技术涉及的多肽Sylvestin能够抑制血栓形成。通过动物模型证实它具有很强的抗血栓和抑制急性脑缺血活性。专利技术人将本专利技术的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。专利技术人将本专利技术的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的抗血栓性的森林山蛭Sylvestin肽及其基因和应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：森林山蛭抗血栓肽Sylvestin是森林山蛭抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的氨基酸序列(SEQIDNO:1)为：TSEPVCACPKMLFWVCGKDGETYTHPCIAKCHNVEVEHDGKCK。森林山蛭抗血栓肽基因的克隆包括:森林山蛭唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选森林山蛭抗血栓肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’AAACCTCGGAACCGGTATGT3’，PCR另一扩增引物为3’PCRPrimer引物，其序列为5’CCGAGGTTTGGTGGCTCATT3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码森林山蛭抗血栓肽的由316个核苷酸组成，自5’端至3’端序列(核苷酸序列SEQIDNO:2)为:GGGAACCCGAAACGGGCATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTAAACCTCGGAACCGGTATGTGCATGCCCAAAAATGCTATTTTGGGTTTGTGGTAAAGATGGTGAGACTTACACCCATCCTTGCATTGCAAAATGCCATAATGTTGAAGTTGAACATGATGGGAAGTGCAAATGAAAGGGACCATTCTTCGAAATTGCCTGAAACTTAAAAATATTGATTTGAATTTAATTAATTCTTATTAATTATAACGTTTCATCATAATAAATGAATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA其中55-183的片段编码森林山蛭抗血栓肽成熟肽。森林山蛭抗血栓肽基因作为基因工程制备森林山蛭抗血栓肽的应用。森林山蛭抗血栓肽的分离纯化方法：收集的森林山蛭匀浆液首先过凝胶层析柱SephadexG-50，收集具有抗血栓活性的峰，冻干，过反向高压液相(RP-HPLC)C4、C18柱，纯化得到森林山蛭抗血栓肽。森林山蛭抗血栓肽的化学合成方法：根据Edman降解法测得序列和编码森林山蛭抗血栓肽肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成其全序列。通过HPLC反向柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。合成的抗血栓肽溶于灭菌水，用于活性测定。一种药物组合物，该药物包括：a.权利要求1所述的抗血栓肽Sylvestin或药学上能接受的盐；b.药学上能接受的载体或赋形剂。本专利技术的有益效果在于:分离纯化得到森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，并克隆得到其cDNA序列。该抗血栓肽能够抑制FXIIa、kallikrein，有极显著的抗血栓和抑制急性脑缺血作用。另外该抗血栓肽具有结构简单、人工合成方便、抗血栓活性强，能作为抑制FXIIa、kallikrein的试剂和制备抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。附图说明图1显示森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的抗血栓作用。图2显示森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的抗急性脑缺血作用。具体实施方式下面用实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此。森林山蛭抗血栓肽基因克隆：1.森林山蛭总RNA提取：(1)迅速从液氮中取出多条山蛭，用剪刀剪下山蛭前端(包括山蛭口腔和咽部)，总重量100mg左右，放入研钵中，加入液氮后充分研磨。待研成粉末状后，加入1mlTrizol提取缓冲液(Invitrogen)，与液氮共研磨。待Trizol溶化，将研钵中全部液体吸出至1.5ml离心管中，室温放置5min。(2)加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置5min；4℃，12000g离心10min；吸取上层无色水相至新的1.5ml离心管中(尽量多吸上层液体，但一定要避免吸到中下层，中层白色为蛋白沉淀，粉红色下层为酚-氯仿)。(3)加入等体积4℃预冷异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min，4℃，12000g离心10min，管底微量沉淀为RNA，用移液枪轻微吸去上清。(4)沉淀加入1ml75％冰上本文档来自技高网...

【技术保护点】
森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
1.森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。2.编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的基因，其特征在于，由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列组成。3.根据权利要求1所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述抗血栓肽Sylvestin在制备FXIIa和kallikrein抑制剂中的应用。4.根据权利要求1所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述抗血栓肽Sylvestin在制备抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。5.一种药物组合物，其特征在于，该药物包括：a.权利要求1所述的抗血栓肽Sylvestin或药学上能接受的盐；b.药学上能接受的载体或赋形剂。6.根据权利要求1所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述抗血栓肽Syl...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖仞，刘伟慧，龙承波，吕秋敏，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53