一种比伐卢定的制备及纯化方法技术

本发明专利技术是一种比伐卢定的制备及纯化方法，具体方法为：以2‑Cl‑Resin为载体，以保护的氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，经缩合、脱保护依次得到保护的肽片段，由两个肽片段固相合成比伐卢定，两个肽片段主要在Gly处按一定摩尔比连接，包括10肽+10肽片段法，12肽+8肽片段法，13肽+7肽片段法，最后经裂解剂脱掉保护基及树脂，并经高效液相制备纯化、冷冻干燥，得比伐卢定纯品，其中优选10肽+10肽片段制备纯化法。本发明专利技术方法制备的比伐卢定纯度和收率高，经检测比伐卢定中未发现光学异构体，同时反应条件温和，成本低，条件简单，易于产业化。

A method for the preparation and purification of a new drug

The invention is a kind of bivalirudin preparation and purification method, the specific method is: 2 Cl Resin as the carrier, to protect the amino acids as raw materials, amino acid dosage and resin loading amount according to a certain ratio, by condensation, deprotection of peptide fragments obtained by two protection. Peptide solid phase synthesis bivalirudin, two peptide fragments mainly at Gly are connected in a certain molar ratio, including 10 +10 peptide fragments, 12 +8 peptide fragments, 13 +7 peptide fragment method, finally after removing the protection base cracking agent and resin, and by high performance liquid chromatography was prepared and purified, frozen dry, more than Dingchun of Lu, preferably 10 +10 peptide fragment preparation and purification method. The preparation method of the invention, bivalirudin high purity and yield, the detection of Lu Dingzhong found no optical isomers, and mild reaction conditions, low cost, simple and easy industrialization.

【技术实现步骤摘要】
一种比伐卢定的制备及纯化方法
本专利技术为药物合成领域，具体为一种多肽药物比伐卢定的合成方法。
技术介绍
比伐卢定，英文名Bivalirudin，商品名Angiomax，由美国Medicines公司申请，2000年12月经FDA批转在美国上市，作为一种直接凝血酶抑制剂，它来源于水蛭素衍生物，是一种化学合成的含20个氨基酸的多肽，是凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂。其相对分子质量为2180.29，分子式：C98H138N24O33，氨基酸序列为：D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。早期的临床研究显示，比伐卢定抗凝疗效确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比更为安全，对于接受经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的患者，比伐卢定可用于替代肝素，并且随着对比伐卢定临床试验的不断研究，其在别的适应症方面亦表现出了不错的治疗效果，因此比伐卢定的未来应用前景极为广阔。关于比伐卢定的制备方法，国内外已有大量报道。合成方法包括了固相合成、液相合成、固液相合成，本专利主要关注比伐卢定固相合成方法。多数已报道的固相合成方法采用氨基酸逐个偶联合成，周期长，逐步偶联时树脂反应难以完全，因固相载体选用的取代值限制，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难，且随着反应进行，树脂上的肽段变长，对于后上的活性较低的氨基酸，反应困难或不完全。而部分报道虽对上述方法有所改进，在逐个偶联的氨基酸中，部分肽段采用一次性接入的制备方法，但对于后续的其他氨基酸接入，对于氨基酸接入反应的难易度及完全度是一样的，不会有改善。本专利技术采用两个肽片段分别固相合成，每个片段的收率都很高，且接入点选择Gly处，由于其活性强，且空间位阻小，使比伐卢定总收率也很高，且经检测比伐卢定中未发现光学异构体，同时反应条件温和，成本低，条件简单，易于产业化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有方法合成收率低、生产成本高、产品纯化困难等技术的不足，提出一种新的比伐卢定的制备及纯化方法，该方法显著提高了比伐卢定的收率与纯度，反应条件简单可控，易于工业化生产。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以2-Cl-Resin为载体，以保护的氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，经缩合、脱保护依次得到保护的肽片段，由两个肽片段固相合成比伐卢定，两个肽片段主要在Gly处按一定摩尔比连接，包括10肽+10肽片段法，12肽+8肽片段法，13肽+7肽片段法，最后经裂解剂脱掉保护基及树脂，并经高效液相制备纯化、冷冻干燥，得比伐卢定纯品，其中优选10肽+10肽片段制备纯化法。1、其中，所述的一种比伐卢定的制备及纯化方法中，10肽+10肽片段法，制备及纯化步骤如下：(1)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc和/或Boc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，缩合、脱保护依次得到保护的[1-10]肽树脂，从树脂上裂解下来后进行纯化，纯化过程中加入有机溶剂，饱和烷烃、醚类、醚类与烷烃类溶剂的混合溶剂，优选正己烷、正庚烷、乙醚、MTBE、EA-PE、CH2Cl2，得到白色固体片段1，片段1的结构如下：Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH；(2)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，缩合、脱保护依次得到保护的[11-20]肽树脂，记为片段2，结构如下：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；(3)片段1与片段2按一定摩尔比固相接入片段2树脂，得到序列为：Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(OtBu)-Leu-树脂使用裂解剂脱掉保护基及树脂，并经高效液相制备纯化、冷冻干燥，即得比伐卢定纯品。根据所述的一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中步骤(1)与(2)中所用到的2-Cl-Resin取代度为0.5mmol～2.0mmol/g，优选为0.8～1.5mmol/g；所述脱保护试剂为20％哌啶DMF溶液，缩合过程中所用的缩合剂组合为HATU或DIC与HOBT的组合。根据所述的一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，缩合过程中所使用的有机碱为DIPEA、TEA、NMR中的任意一种。根据所述一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，氨基酸缩合反应时间为0.5-4小时。根据所述一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，氨基酸与树脂载样量摩尔比为2∶1～5∶1。根据所述一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，步骤(1)中片段1的裂解剂为CH2Cl2-TFE(比例为1～4∶1，V/V)或者CH2Cl2-TFE-AcOH(6～8∶1～2∶1～2，v/v/v)，优选CH2Cl2-TFE(4∶1)，CH2Cl2-TFE-AcOH(8∶1∶1)。根据所述一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，步骤(1)中片段1的纯化步骤中，加入饱和烷烃、醚类、CH2Cl2、醚类与烷烃类溶剂的混合溶剂、CH2Cl2，优选正己烷、正庚烷、乙醚、MTBE、EA-PE，CH2Cl2。根据所述一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，片段1与片段2的摩尔比为1.1～2∶1。根据所述一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，步骤(3)中比伐卢定肽树脂的裂解剂为CH2Cl2-TFA(1～4∶1)或TFA-TIPS-H2O(90～95∶2.5～5∶2.5～5)，优选TFA-TIPS-H2O(90～95∶2.5～5∶2.5～5)。根据所述一种比伐卢定的制备及纯化方法，其中，步骤(3)中纯化使用高效液相色谱法，纯化条件：以十八烷基键合硅胶为固定相(YMC公司的TriartPrepC18-S)，色谱柱规格为250×30mm，粒径10μm，粒空隙12nm，流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，检测波长210nm，设置洗脱梯度。2、其中，所述的一种比伐卢定的制备及纯化方法中，12肽+8肽片段法，制备及纯化步骤如下：(1)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc和/或Boc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，经缩合、脱保护依次得到保护的[1-8]肽树脂，从树脂上裂解下来后进行纯化，纯化过程中加入有机溶剂，饱和烷烃、醚类、醚类与烷烃类溶剂的混合溶剂，优选正己烷、正庚烷、乙醚、MTBE、EA-PE、CH2Cl2，得到白色固体片段1，片段1的结构如下：Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；(2)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc保护氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种比伐卢定的制备及纯化方法，其特征在于，以2‑Cl‑Resin为载体，以保护的氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，经缩合、脱保护依次得到保护的肽片段，然后两个肽片段固相合成比伐卢定，两个肽片段主要在Gly处按一定摩尔比连接，所述连接方法包括10肽+10肽片段法，12肽+8肽片段法，13肽+7肽片段法，最后经裂解剂脱掉保护基及树脂，并经高效液相制备纯化、冷冻干燥，得比伐卢定纯品，其中优选10肽+10肽片段制备纯化法。

【技术特征摘要】
1.一种比伐卢定的制备及纯化方法，其特征在于，以2-Cl-Resin为载体，以保护的氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，经缩合、脱保护依次得到保护的肽片段，然后两个肽片段固相合成比伐卢定，两个肽片段主要在Gly处按一定摩尔比连接，所述连接方法包括10肽+10肽片段法，12肽+8肽片段法，13肽+7肽片段法，最后经裂解剂脱掉保护基及树脂，并经高效液相制备纯化、冷冻干燥，得比伐卢定纯品，其中优选10肽+10肽片段制备纯化法。2.根据权利要求1所述的一种比伐卢定的制备及纯化方法，其特征在于，所述的10肽+10肽片段法，制备及纯化步骤如下：(1)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc和/或Boc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，缩合、脱保护依次得到保护的[1-10]肽树脂，从树脂上裂解下来后进行纯化，得到白色固体片段1，片段1的结构如下：Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH；(2)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，缩合、脱保护依次得到保护的[11-20]肽树脂，记为片段2，结构如下：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；(3)片段1与片段2按一定摩尔比固相接入片段2树脂，使用裂解剂脱掉保护基及树脂，并经高效液相制备纯化、冷冻干燥，即得比伐卢定纯品。3.根据权利要求1所述的一种比伐卢定的制备及纯化方法，其特征在于，所述的12肽+8肽片段法，制备及纯化步骤如下：(1)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc和/或Boc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，缩合、脱保护依次得到保护的[1-8]肽树脂，从树脂上裂解下来后进行纯化，得到白色固体片段1，片段1的结构如下：Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；(2)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，缩合、脱保护依次得到保护的[9-20]肽树脂，记为片段2，结构如下：Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂；(3)片段1与片段2按一定摩尔比固相接入片段2树脂，使用裂解剂脱掉保护基及树脂，并经高效液相制备纯化、冷冻干燥，即得比伐卢定纯品。4.根据权利要求1所述的一种比伐卢定的制备及纯化方法，其特征在于，所述的13肽+7肽片段法，制备及纯化步骤如下：(1)以2-Cl-Resin为载体，通过固相合成方法，以Fmoc和/或Boc保护氨基酸为原料，氨基酸投料量与树脂载样量按一定摩尔比，缩合、脱保护依次得到保护的[...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振国，陈艳明，刘东明，韦怀福，南志远，郭亚芳，周剑波，
申请(专利权)人：牡丹江友搏药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23