一种比伐卢定的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种比伐卢定的制备方法，具体涉及药物多肽比伐卢定的高效合成。本方法采用Fmoc固相多肽合成法，在固相载体上依次偶联各个N端保护的氨基酸得到比伐卢定肽树脂，肽树脂经酸试剂裂解得到粗肽，粗肽经C18制备色谱柱纯化得到比伐卢定纯品。比伐卢定序列中有五个Gly，常规Fmoc固相多肽合成中Gly对应原料为Fmoc‑Gly‑OH，本发明专利技术采用Fmoc‑Gly(DMB)‑OH为原料，替换其中的一个或多个Fmoc‑Gly‑OH，有效提高了甘氨酸及其后续氨基酸的偶联效率，避免了Gly的缺失或多加现象。该方法操作简单，粗品纯度高，制备后产品纯度达到99.2％，单杂小于0.5％，具备良好的工业化生产前景。

【技术实现步骤摘要】
一种比伐卢定的制备方法
本专利技术涉及多肽类药物合成领域，具体涉及一种新的比伐卢定的制备方法。
技术介绍
比伐卢定(Bivalirudin)是一个含20个氨基酸的水蛭素衍生片段。其氨基酸序列为D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Gly10-Asp11-Phe12-Glu13-Glu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19-Leu20-OH。通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用。由于凝血酶可水解多肽序列中Arg3和Pro4之间的肽键，使多肽失活，所以比伐卢定的抗凝作用是短暂而可逆的。早期的临床研究认为：比伐卢定抗凝治疗效果显著，出血概率较低，比传统的肝素抗凝治疗更为安全。早期比伐卢定合成专利由Biogen和Cambridge公司于1993年得到授权，专利号为US5196404，该专利采用标准Boc化学固相多肽合成法，需要用剧毒的HF作为裂解试剂，裂解时需要特殊的反应装置及操作人员防护设备，不适合规模化生产。专利CN101094867、CN101033249和CN101555274采用标准Fmoc化学固相多肽合成法，避免了强酸切割的风险，但粗品副产物较多,纯品收率仅为14％左右(CN101033249)。专利如CN101475631、CN103864895、CN102816208和CN105273062采用多肽片段液相拼接的方法来合成比伐卢定，将比伐卢定分成三个、四个或五个多肽片段，在液相中完成片段的拼接。该方法片段与片段间缩合效率不高，多肽片段原料及每步拼接产物都需要纯化，废液量大，生产成本较高。专利如CN102286076、CN102532274、CN102924575、CN102731624、CN105218644、CN104031127、CN103242431和US20130196920采用固相片段合成法，以氨基酸和多肽片段为原料，在固相载体上依次拼接完成树脂肽的合成，裂解得到比伐卢定粗品。原料多肽片段生产成本较高，固相上片段缩合效率较低，多肽片段需要过量投料且难以回收套用，造成了大量的原料浪费，给成本和环境都造成了压力。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供了一种低成本，高收率的比伐卢定制备方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种比伐卢定的制备方法，包括以下步骤：1)将氨基酸Fmoc-Leu-OH连接到固相树脂上,得到Fmoc-Leu-固相树脂；2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂的保护基，以带保护氨基酸为原料，依次偶联得到比伐卢定树脂肽；偶联比伐卢定第5、6、7、8、10位的甘氨酸时，所采用的带保护甘氨酸原料中包含至少一个Fmoc-Gly(DMB)-OH；优选为包含1～2个Fmoc-Gly(DMB)-OH；3)用酸性裂解试剂将比伐卢定从树脂上裂解，经沉淀后分离得到比伐卢定粗品；4)粗品经HPLC分离纯化，得到目标产物比伐卢定。本专利技术比伐卢定的制备方法详细包括以下几个步骤：1)选择聚苯乙烯树脂为固相树脂(含0.5-2.0％(w/w)的二乙烯苯)；将Fmoc-Leu-OH与固相树脂连接，得到Fmoc-Leu-固相树脂；2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂的保护基，以Fmoc保护的氨基酸为原料，依次连接各个氨基酸得到11-20的树脂肽Fmoc-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂；再以1～2个Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH为原料，依次连接5-10位氨基酸得到树脂肽Fmoc-Gly(X)5-Gly(X)6-Gly(X)7-Gly(X)8-Asn(Trt)9-Gly(X)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂；X为甘氨酸上的氨基保护基DMB或H。在该树脂肽上继续依次连接Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,D-Boc-Phe-OH得到比伐卢定树脂肽D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly(X)5-Gly(X)6-Gly(X)7-Gly(X)8-Asn(Trt)9-Gly(X)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂；3)在酸性裂解试剂中切割树脂，同时脱除DMB及侧链保护基，乙醚沉淀后分离得到比伐卢定粗肽。4)粗肽经高效液相色谱分离纯化，得到比伐卢定纯品。本专利技术所用的固相树脂为CTC树脂或Wang树脂，Fmoc-Leu-OH与CTC树脂在碱性条件下进行酯化反应得到Fmoc-Leu-CTC树脂，Fmoc-Leu-OH与Wang树脂在偶联试剂条件下进行酯化反应得到Fmoc-Leu-Wang树脂；所述Fmoc-Leu-CTC树脂或Fmov-Leu-Wang树脂的取代度为0.4-1.2mmol/g树脂，优选0.5-0.9mmol/g树脂。本专利技术步骤2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂保护基的过程中，所采用的脱Fmoc保护基的试剂为20％(v/v)哌啶/DMF溶液，脱保护时间为15-60min，优选20-40min。步骤2)所述偶联的过程中所采用的偶联试剂选自DCC、EDC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/HOBt/NMM、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/HOBt/DIEA、BOP/HOAt/NMM、PyBOP/HOAt/DIEA中的任意一种。所述的偶联反应在DMF溶剂中进行，偶联反应时间为0.5-2.0h，优选0.5-1.5h，茚三酮检测树脂呈阴性则表示偶联反应完全。本专利技术步骤2)中在偶联时所使用的带保护氨基酸投料量为所述Fmoc-Leu-固相树脂取代度的1.0-3.0倍量，优选1.2-2.5倍量。比伐卢定序列中有五个Gly，常规Fmoc固相多肽合成中Gly对应原料为Fmoc-Gly-OH，本专利技术在偶联过程中所用的甘氨酸原料不仅限于Fmoc-Gly-OH，对于序列中的五个甘氨酸单元，本专利技术采用Fmoc-Gly(DMB)-OH为原料，替换其中的一个或多个Fmoc-Gly-OH原料，优选为替换其中的1～2个Fmoc-Gly-OH原料。有效提高了甘氨酸及其后续氨基酸的偶联效率，避免了Gly的缺失或多加现象。依次偶联序列中的各个氨基酸得到含DMB的树脂肽D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly(X)5-Gly(X)6-Gly(X)7-Gly(X)8-Asn(Trt)9-Gly(X)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将氨基酸Fmoc‑Leu‑OH连接到固相树脂上,得到Fmoc‑Leu‑固相树脂；2)脱除Fmoc‑Leu‑固相树脂的保护基，以带保护氨基酸为原料，依次偶联得到比伐卢定树脂肽；偶联比伐卢定第5、6、7、8、10位的甘氨酸时，所采用的带保护甘氨酸原料中包含至少一个Fmoc‑Gly(DMB)‑OH；3)用酸性裂解试剂将比伐卢定从树脂上裂解，经沉淀后分离得到比伐卢定粗品；4)粗品经HPLC分离纯化，得到目标产物比伐卢定。

【技术特征摘要】
1.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将氨基酸Fmoc-Leu-OH连接到固相树脂上,得到Fmoc-Leu-固相树脂；2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂的保护基，以带保护氨基酸为原料，依次偶联得到比伐卢定树脂肽；偶联比伐卢定第5、6、7、8、10位的甘氨酸时，所采用的带保护甘氨酸原料中包含至少一个Fmoc-Gly(DMB)-OH；3)用酸性裂解试剂将比伐卢定从树脂上裂解，经沉淀后分离得到比伐卢定粗品；4)粗品经HPLC分离纯化，得到目标产物比伐卢定。2.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的固相树脂为CTC树脂或Wang树脂。3.根据权利要求1或2所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述Fmoc-Leu-固相树脂的取代度为0.4-1.2mmol/g，优选为0.5-0.9mmol/g。4.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤2)所述偶联的过程中所采用的偶联试剂选自DCC、EDC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/HOBt/NMM、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/HOBt/DIEA、BOP/HOAt/NMM、PyBOP/HOAt/DIEA中的任意一种。5.根据权利要求1所述的比伐卢...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈军伟，章方良，王翔，
申请(专利权)人：江苏金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32