具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞制造技术

本发明专利技术提供了一种具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞。具体地，本发明专利技术提供了一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞，并且所述细胞的CAR结构中包含细胞自杀元件。本发明专利技术对CAR结构中的CD47 scFv的亲和力作出了优化并选择合适的CAR‑T细胞输注方式，从而使其对正常组织的毒性降低到人体可接受水平。同时在确保CD47 CAR‑T细胞的活性的基础上，添加细胞自杀元件，用于控制CAR‑T细胞的活性和CRS等相关毒性，增强安全性。

Engineering Immune Cells Targeting CD47 with Suicide Gene Switch

The invention provides an engineered immune cell targeting CD47 with a suicide gene switch. Specifically, the invention provides a chimeric antigen receptor T cell targeting CD47, and the CAR structure of the cell contains a cell suicide element. The present invention optimizes the affinity of CD47 scFv in the CAR structure and chooses an appropriate transfusion mode of CAR T cells so as to reduce its toxicity to normal tissues to an acceptable level in human body. At the same time, on the basis of ensuring the activity of CD47 CAR T cells, cell suicide elements were added to control the activity of CAR T cells and related toxicity such as CRS, so as to enhance safety.

【技术实现步骤摘要】
具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞
本专利技术涉及免疫治疗领域，具体地涉及具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞，更具体地涉及一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。嵌合免疫抗原受体(Chimericantigenreceptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chainvariablefragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。但是在实体肿瘤治疗中，研究人员发现在小鼠中注射meso-cart能够约束肿瘤的生长，但是不能治疗肿瘤。这可能是由于肿瘤微环境中负调控因子的上调导致cart功能的减退，如在肿瘤微环境中，T细胞表面PD-1(programmeddeathprotein-1)表达上调限制了T细胞的功能。B细胞淋巴瘤患者的外周血及生发中心样B细胞中CD47的表达水平都明显高于正常B细胞。同时，研究还发现不同病理组织学类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL)中CD47均有表达，如弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡细胞性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞性淋巴瘤(FCL)等。CD47是治疗肿瘤的一个潜在靶点，目前研究主要集中在使用靶向CD47的抗体来进行肿瘤治疗，CD47抗体治疗是通过DC细胞和CD8+T发挥肿瘤杀伤效应的。DC细胞通过CD47抗体和亲吞噬分子协同作用，吞噬肿瘤细胞，并提呈肿瘤相关抗原给CD8+T，进而发挥CD8+T对肿瘤的特异性杀伤作用。CD47作为细胞表面分子，在肿瘤细胞上高表达，因此可以设计靶向CD47的免疫嵌合受体T细胞(CAR-T)，对肿瘤进行治疗。在CD47CAR设计过程中，需要平衡CAR对抗原的亲和力，筛选出适当亲和力，CAR对正常组织的杀伤毒性在人体可接受的水平。选择合适的CAR-T细胞输注方式对减弱CD47CAR-T的毒性会有帮助。与抗体治疗相比，CAR-T细胞治疗的优势有：抗体的作用只是短暂的，停药后抗体阻断效果就会消失；有效抗体研发困难；抗体药物昂贵；抗体阻断CD47信号后，肿瘤细胞被吞噬细胞识别杀死，在一些肿瘤负荷较高的病人中，没有足够的吞噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬，达不到治疗效果，而CAR-T细胞靶向肿瘤细胞表面CD47分子，被激活后直接对肿瘤细胞进行杀伤，不依赖于其他细胞。目前，本领域还没有成熟的靶向CD47的CAR-T细胞，本领域迫切需要开发靶向CD47的CAR-T细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞，更具体地在于提供一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。本专利技术的另一目的在于对CD47CAR-T的scFv亲和力进行优化，并加入安全开关来控制CD47CAR-T的毒性。在本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述的CAR靶向CD47，并且所述的CAR包含细胞自杀元件和/或蛋白标签。在另一优选例中，所述的CAR的结构选自下组的结构：(i)L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-K-A；(ii)L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-A-K；(iii)K-A-L-scFv-H-TM-C-CD3ζ；和(iv)A-K-L-scFv-H-TM-C-CD3ζ；式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；scFv为靶向CD47的抗体单链可变区序列；H为任选的铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；K为任选的细胞自杀元件；A为任选的蛋白标签。在另一优选例中，所述的CAR具有下式I结构：L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-K-A(I)。在另一优选例中，所述的scFv(靶向CD47的抗体)为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的抗体。在另一优选例中，所述的A为选自下组的一种或多种蛋白标签：绿色荧光蛋白(GFP)、NGFR截断体(NGFRt)、EGFR截断体(EGFRt)、ΔCD19、ΔCD20、或其组合。在另一优选例中，所述GFP的氨基酸序列如SEQIDNO.:3的508-746位氨基酸所示。在另一优选例中，所述的元件A与元件K通过P2A连接。在另一优选例中，所述的元件K或A与CD3ζ或L通过P2A连接。在另一优选例中，所述的P2A序列如SEQIDNO.:3的489-507位氨基酸所示。在另一优选例中，所述的L-scFv-H-TM-C-CD3ζ与A、K的相对位置可以自由排列；在另一优选例中，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：B-D-F(II)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；B为自杀基因诱导元件；D为柔性接头；F为自杀基因。在另一优选例中，所述的细胞自杀元件包含iCasp9。在另一优选例中，所述的自杀基因为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的编码基因(Caspase9基因)。在另一优选例中，所述的B为FKBP12-F36V结构域。在另一优选例中，所述的FKBP12-F36V结构域包含FKBP结构域，且FKBP结构域的第36位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。在另一优选例中，所述D的序列如SEQIDNO.:3的876-880位氨基酸所示(Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)。在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。在另一优选例中，所述的scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.:3的第23-262位所示。在另一优选例中，所述自杀基因元件的氨基酸序列如SEQIDNO.:3的769-1168位氨基酸所示。在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。在另一优选例中，TM包括CD8来源的跨膜区，和/或CD28来源的跨膜区。在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。在另一优选例中，C包括4-1BB来源的共刺激信号分子，和/或CD28来源的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述的CAR靶向CD47，并且所述的CAR包含细胞自杀元件和/或蛋白标签。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述的CAR靶向CD47，并且所述的CAR包含细胞自杀元件和/或蛋白标签。2.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的细胞自杀元件选自下组：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、或其组合。3.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：B-D-F(II)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；B为自杀基因诱导元件；D为柔性接头；F为自杀基因。4.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的蛋白标签选自下组：绿色荧光蛋白(GFP)、NGFR截断体(NGFRt)、EGFR截断体(EGFRt)、ΔCD19、ΔCD20、或其组合。5.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的CAR的结构选自下组的结构：(i)L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-K-A；(ii)L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-A-K；(iii)K-A-L-scFv-H-TM-C-CD3ζ；和(iv)A-K-L-scFv-H-TM-C-CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹卫，何佳平，刘丽萍，马安云，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31