香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法技术

本发明专利技术提供香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法，将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛MDA含量以及超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD的活力；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较高，SOD、CAT和POD活力相对较强，MDA含量相对较低时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较强；反之，则相对较弱。本发明专利技术不仅证实了胚性愈伤组织可以作为鉴定香樟抗寒性的良好材料，而且揭示了香樟胚性愈伤组织在低温胁迫下表达模式以及各生理生化指标变化规律，并筛选获得该材料响应低温胁迫最剧烈的时刻和较敏感的生理指标。

Evaluation Method of Cold Resistance of Embryogenic Callus of Cinnamomum camphora

The present invention provides a method for evaluating cold resistance of camphor embryogenic callus. Camphor embryogenic callus is treated under low temperature stress, and the contents of proline, soluble sugar, malondialdehyde MDA and the activities of superoxide dismutase SOD, catalase CAT and peroxidase POD in camphor embryogenic callus are determined. When the contents of proline and soluble sugar are relatively high, the activities of SOD, CAT and POD are determined. When the content of MDA is relatively low, the cold resistance of the corresponding camphor embryogenic callus is relatively strong; on the contrary, the cold resistance of the corresponding camphor embryogenic callus is relatively weak. The invention not only confirms that embryogenic callus can be used as a good material for identifying cold resistance of camphor, but also reveals the expression pattern of embryogenic callus under low temperature stress as well as the changes of physiological and biochemical indexes, and screens and obtains the most acute time and sensitive physiological indexes of the material in response to low temperature stress.

【技术实现步骤摘要】
香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法
本专利技术涉及一种香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法。
技术介绍
香樟(Cinnamomumcamphora)作为亚热带地区重要的材用和特种经济树种，不仅发挥着重要的园林绿化价值，且其材质上乘，是贵重家具、造船和雕刻等的重要用材，此外，樟树皮、果和根等具有一定的药用价值。本申请人前期从香樟中分离得到4个CcCBF基因，命名为CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc和CcCBFd(GenBank登录号分别为KJ958932、KJ958933、KP336741和KP336742，以下简称CcCBFs基因)。欲在香樟中研究CcCBFs基因功能，然而，由于木本植物本身的特殊性，使其遗传转化和再生周期较长，通过获得转基因香樟植株研究CcCBFs基因功能不切实际。因此，发掘快速准确基因功能研究材料，具有重要意义。胚性愈伤组织分裂活性强，且具备胚胎发生能力，研究发现以香樟胚性愈伤组织作为受体，能获得较理想的转化效果，香樟胚性愈伤组织可能是抗寒基因功能验证的好材料。然而，目前尚不清楚香樟胚性愈伤组织能否准确快速的响应低温胁迫。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法。本专利技术通过荧光定量PCR技术，分析香樟胚性愈伤组织在分子水平上感知低温胁迫的能力，筛选获得胚性愈伤组织相对表达量反应最剧烈的时刻；并通过测定渗透调节物质、膜代谢产物以及酶活性等指标，分析其在植物组织水平响应低温胁迫的能力，筛选获得胚性愈伤组织应对低温较敏感的生理指标及对应的时刻，从而建立香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系。本专利技术提供香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法，将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛MDA含量以及超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD的活力；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较高，SOD、CAT和POD活力相对较强，MDA含量相对较低时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较强；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较低，SOD、CAT和POD活力相对较弱，MDA含量相对较高时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较弱。作为优选，所述低温胁迫处理是在4℃和/或-4℃下处理0.5-24h。作为优选，所述处理时的光照强度为3000lx，光照时间16h·d-1。作为优选，所述将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛MDA含量以及超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD的活力的具体方法为：将香樟胚性愈伤组织在4℃下处理2h，测定可溶性糖含量；将香樟胚性愈伤组织在4℃下处理8h，测定脯氨酸含量和SOD活力；将香樟胚性组织在4℃下处理12h，测定丙二醛含量和CAT活力。作为优选，所述将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛MDA含量以及超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD的活力的具体方法为：将香樟胚性愈伤组织在-4℃下处理2h，测定可溶性糖和丙二醛的含量以及POD活力；将香樟胚性愈伤组织在-4℃下处理8h，测定脯氨酸含量和CAT活力。香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系的建立，不仅证实了胚性愈伤组织可以作为鉴定香樟抗寒性的良好材料，而且揭示了香樟胚性愈伤组织在低温胁迫下表达模式以及各生理生化指标变化规律，并筛选获得该材料响应低温胁迫最剧烈的时刻和较敏感的生理指标。该体系的建立可以短时间内，对大批量不同香樟胚性愈伤组织材料的抗寒性进行快速、简便评价，为将香樟抗寒基因转入胚性愈伤组织研究其功能奠定研究基础。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为香樟胚性愈伤组织对低温胁迫的表达模式分析。图2为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸变化情况。图3为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织可溶性糖变化情况。图4为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织丙二醛变化情况。图5为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织SOD变化情况。图6为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织CAT变化情况。图7为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织POD变化情况。图8为香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例11材料与方法1.1材料以实验室诱导获得的香樟胚性愈伤组织为试材，进行低温胁迫处理。1.2方法1.2.1低温胁迫处理将香樟胚性愈伤组织置于4℃人工气候箱中(光照强度3000lx，光照时间16h·d-1)，进行低温胁迫处理，以25℃(光照强度3000lx，光照时间16h·d-1)处理作为空白对照。低温处理0、0.5、1、2、4、8、12和24h后，分别取样，每个取样点设3个生物学重复，液氮速冷后置于-80℃冰箱保存，用于荧光定量PCR。将香樟胚性愈伤组织分别进行4℃和-4℃低温胁迫处理(方法同上)，低温处理0、2、8、12和24h后，分别取样，每个取样点设3个生物学重复，进行生理指标的测定。1.2.2实时荧光定量PCR利用EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱公司)提取香樟胚性愈伤组织RNA，检测RNA样品浓度和样品完整性，然后反转录合成cDNA。以CcEF1α为内参基因，CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc和CcCBFd为目标基因，进行qRT-PCR(quantitativereal-timePCR)，每个样品设置3次重复。1.2.3低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸含量的测定由于酸性茚三酮可使游离于磺基水杨酸的脯氨酸发生显色反应，然后用甲苯处理可将色素萃取出来，色素的颜色可反应出脯氨酸的含量。因此，可利用改良的酸性茚三酮比色法，经标准曲线的绘制、总游离脯氨酸的提取以及总游离脯氨酸含量的测定等过程，测定4℃和-4℃低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸含量。1.2.3.1标准曲线的绘制用标准母液配置成每毫升含0(作空白)、1、2、3、4、5μg脯氨酸的溶液各2mL，分别放入试管中，然后依次向试管内加入2mL冰乙酸和2mL2.5％酸性茚三酮，摇匀，沸水浴30分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，加入3mL甲苯后震荡，使色素全部转移至甲苯溶液中，在520nm波长下测定吸光值。以脯氨酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。1.2.3.2总游离脯氨酸的提取准确称取0.1g香樟胚性愈伤组织，用研钵迅速研碎后加4mL3％磺基水杨酸制成组织匀浆，然后将组织匀浆倒入具塞试管中沸水浴10分钟。1.2.3.3总游离脯氨酸含量的测定吸取2mL上清提取液于具塞试管中，然后分别加入2mL冰乙酸和2mL2.5％酸性茚三酮，沸水浴30分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，加入3mL甲苯后震荡，震荡分层后取3mL上清液于干净离心管中，5000rpm离心5分钟，测波长为520nm时的吸光值。每个处理重复三次，根据吸光度在标准曲线上查得总游离脯氨酸含量。1.2.3.4总游离脯氨酸含量计算式中：y——样品中脯氨酸含量，μg·g-1；C——从标准曲线查的脯氨酸含量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法，其特征在于：将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛MDA含量以及超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD的活力；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较高，SOD、CAT和POD活力相对较强，MDA含量相对较低时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较强；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较低，SOD、CAT和POD活力相对较弱，MDA含量相对较高时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较弱。

【技术特征摘要】
1.香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法，其特征在于：将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛MDA含量以及超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD的活力；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较高，SOD、CAT和POD活力相对较强，MDA含量相对较低时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较强；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较低，SOD、CAT和POD活力相对较弱，MDA含量相对较高时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较弱。2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述低温胁迫处理是在4℃和/或-4℃下处理0.5-24h。3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于：所述处理时的光照强度为3000lx，光照时间16h·d-1。4.根据权利要求1-3任一项所述的评价方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜丽，周婵，王建格，刘译朗，王圣，韩贝贝，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41