一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法技术

本发明专利技术公开了一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法，属于生物技术领域，本发明专利技术的建立肺炎大鼠模型的方法，对大鼠无创安全，在整个过程中不会损伤大鼠其它器官，有效避免大鼠死亡。且操作简单，成功率高。利用本发明专利技术建立的肺炎大鼠模型，肺泡灌洗液中铜绿假单胞菌显著增加，炎症因子IL‑4、TNF‑α显著升高，粘附因子IFN‑γ的水平明显降低，且白细胞数目显著增加，同时肺指数也显著增加，表明模型建立较好。

A Method for Preparing Pneumonia Rat Model and Its Evaluation Method

The invention discloses a method for preparing rat model of pneumonia and a method for evaluating the model, which belongs to the field of biotechnology. The method for establishing rat model of pneumonia is noninvasive and safe to rats, does not damage other organs of rats in the whole process, and effectively avoids rat death. The operation is simple and the success rate is high. In the rat model of pneumonia established by the present invention, Pseudomonas aeruginosa in alveolar lavage fluid increased significantly, inflammatory factors IL_4 and TNF_alpha increased significantly, the level of adhesion factor IFN_gamma decreased significantly, the number of white blood cells increased significantly, and the lung index increased significantly, indicating that the model was well established.

【技术实现步骤摘要】
一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法
本专利技术的属于生物
，具体地，涉及一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法。
技术介绍
耐药菌所致肺炎的防治是国际医学界面临的难题。近年，我国因临床多耐药菌株和泛耐药菌株频现，致使其防治工作面临前所未有的挑战。新型有效防治手段的研发时不我待，尤其基于耐药机制的基础研究迫在眉睫，稳定可靠的耐药菌致肺炎模型是其必备的首要环节。由于考虑成本和可操作性的问题，目前国内外多采用啮齿动物(小鼠、大鼠)作为肺炎模型动物。于柏峰等(于柏峰等，重庆医学杂志，2011，40(2)，129-132)将6～8周龄雄性昆明小鼠，气管切开，用富含铜绿假单胞菌PA01(BAA-47TM)的琼脂糖珠灌注小鼠，立即竖起小鼠，保持2min，使菌液流下进入肺内；又如鄢洁等(鄢洁等，世界最新医学信息文摘，2015，15(27)，8-10)将6-8周龄、体重25～30g的清洁级健康雄性昆明小鼠以氯胺酮麻醉小鼠后固定，常规消毒铺巾，严格无菌操作，切开颈部皮肤，钝性分离至皮下组织，暴露上段气管，经气管内穿刺注入铜绿假单胞菌PA01。以上方法均可以构建肺炎模型。但是这些方法依然存在很大的问题，主要体现在以下方面：1、切开气管的方法虽然可以保证感染剂量，但作为一种有创的方法，在操作过程中容易造成动物器官损伤甚至导致实验动物死亡；2、操作复杂，每只小鼠都要进行手术，很难大批量开展实验；3、已经报道的感染模型所使用的铜绿假单胞菌菌株是来自美国的标准株PA01，不能代表国内流行PA菌株的流行情况。另一方面，建立模型后需要对动物模型进行适当评价，然而，目前尚缺乏有效的评价方法。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，专利技术人通过建立不同感染途径的耐药菌致大鼠肺炎模型。并对优选出的滴鼻途径模型进行进一步评价，尤其对肺部疾病特异性标本——肺泡灌洗液(BronchoalveolarLavageFluid，BALF)进行针对性评价，取得了意想不到的效果，从而完成本专利技术。本专利技术的目的是提供一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法。为此，本专利技术的一方面提供一种一种制备肺炎大鼠模型的方法，包括以下步骤：(1)采用戊巴比妥钠麻醉大鼠；(2)将大鼠鼻孔向上倾斜，利用微量加样器将含有铜绿假单胞菌的菌液滴入大鼠鼻腔；(3)改变大鼠体位，使其保持直立30s～3min。在本专利技术的一些实施方案中，在步骤(2)中，将大鼠鼻孔向上倾斜45度。在本专利技术的一些实施方案中，所述菌液的浊度值为0.8-1.2。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述菌液的浊度值为1。在本专利技术的一些实施方案中，滴入鼻腔的菌液体积为0.5-0.8mL。在本专利技术的一些具体实施方案中，滴入鼻腔的菌液体积为0.6mL。在本专利技术的实施方案中，所述大鼠为6-8周龄SD雄性大鼠。本专利技术的第二方面提供一种评价利用本专利技术第一方面所述的方法制备的肺炎大鼠模型的方法，包括以下步骤：(1)对所述肺炎大鼠进行开胸，结扎左主支气管；(2)对右肺进行肺泡灌洗，吸取肺泡灌洗液，并检测肺泡灌洗液中的炎症因子IL-4、TNF-α和粘附因子IFN-γ的水平，其中，当炎症因子IL-4和TNF-α的水平升高，和/或粘附因子IFN-γ水平降低，表明模型建立较好。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤(2)中肺泡灌洗液的制备方法为：以一次性输液器插入主支气管约3-4cm，固定，将3mL生理盐水注入气管内，轻翻肺组织，抽回再灌注，反复抽注5次，最后抽出肺泡灌洗液。在本专利技术的一些实施方案中，进一步包括对肺泡灌洗液中的白细胞进行计数的步骤，其中，白细胞数目增加表明模型建立较好。在本专利技术的一些实施方案中，在获取肺泡灌洗液后，进一步将大鼠的左右叶全肺组织均切下，称重记录，并根据下面公式计算肺指数：肺指数＝肺质量/体质量×100％其中，肺指数增加，表明模型建立较好。在本专利技术的一些实施方案中，进一步利用培养的方法获得肺泡灌洗液中铜绿假单胞菌的数目，其中，数目增加表明模型建立较好。本专利技术的有益效果本专利技术的建立肺炎大鼠模型的方法，对大鼠无创安全，在整个过程中不会损伤大鼠其它器官，有效避免大鼠死亡。本专利技术的方法操作简单，成功率高。本专利技术的评价肺炎大鼠模型的方法，对肺炎大鼠模型进行全方面的评价，包括检测肺泡灌洗液中炎症因子IL-4、TNF-α和粘附因子IFN-γ的水平。附图说明图1示出了各亚组大鼠肺指数变化情况。图2示出了大鼠肺泡灌洗液中白细胞的结果。图3示出了大鼠肺泡灌洗液中IL-4的浓度结果。图4示出了大鼠肺泡灌洗液中TNF-α的浓度结果。图5示出了大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的浓度结果。具体实施方式为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本专利技术的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表专利技术人发现的可以用于实施本专利技术的技术，因此可以视为实施本专利技术的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本专利技术的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本专利技术所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的专利技术的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。实施例1材料与方法1.1实验菌种和动物1.1.1铜绿假单胞菌耐药株编号PA-R003，储备于中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室。此菌经由北京中医药大学东直门医院、首都医科大学附属北京朝阳医院和首都医科大学附属北京中医医院三家三甲医院互证鉴定。开展实验时，以常规方法复苏培养，获取新鲜菌液使用。1.1.2实验动物及分组SD雄性大鼠，6-8周龄，160±10g，24只(北京维通利华实验动物技术有限公司)；随机分为对照组(Control，C)和模型组(Model，M)，每组12只。干预当天设为0天，干预后第5、10和15天分别监测的设为各组的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚组。实验过程中如有死亡自动舍弃。模型干预前适应饲喂3天。实验过程中分笼饲养，每笼4只。饲养条件是恒温20±4℃，光照及黑暗12小时交替，自由进食并饮水。1.2主要试剂与仪器本实验所及仪器均为实验室常规仪器；IFN-γ、TNF-α和IL-4的ELISA试剂盒均为上海依科赛生物制品有限公司产品。31.3干预方法及样本采集1.3.1造模干预分别称重各亚组大鼠，以戊巴比妥钠常规实施麻醉，将大鼠鼻孔处于45度向上倾斜，以0.6mL浊度值为1的菌液，用微量加样器滴入鼻腔，随后改变大鼠体位，使其保持直立体位，大约1min，以确保菌液进入气道。对照组则用0.6mL生理盐水按上述方法滴鼻，记为0天。在造模过程中，有两大重要关键因素，其一是浊度精准的新鲜菌液；其二是大鼠体位及维持时间。1.3.2采集0天样本(1)BALF：实施造模干预后2小时，将实验组和对照组0天亚组大鼠分别无菌开胸，结扎左主支气管，行右肺的肺泡灌洗。BALF的制备：以一次性输液器插入主支气管约3-4cm，固定，将3mL生理盐水注入气管内，轻翻肺组织，抽回再灌注，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备肺炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用戊巴比妥钠麻醉大鼠；(2)将大鼠鼻孔向上倾斜，利用微量加样器将含有铜绿假单胞菌的菌液滴入大鼠鼻腔；(3)改变大鼠体位，使其保持直立30s～3min。

【技术特征摘要】
1.一种制备肺炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用戊巴比妥钠麻醉大鼠；(2)将大鼠鼻孔向上倾斜，利用微量加样器将含有铜绿假单胞菌的菌液滴入大鼠鼻腔；(3)改变大鼠体位，使其保持直立30s～3min。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，将大鼠鼻孔向上倾斜45度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌液的浊度值为0.8-1.2。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，滴入鼻腔的菌液体积为0.5-0.8mL。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大鼠为6-8周龄SD雄性大鼠。6.一种评价利用权利要求1所述的方法制备的肺炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对所述肺炎大鼠进行开胸，结扎左主支气管；(2)对右肺进行肺泡灌洗，吸取肺泡灌洗液，并检测肺泡灌洗液中的炎症因子IL-4、TNF-α和粘附因子IFN-γ的...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁军颖，刘清泉，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京中医医院，
类型：发明
国别省市：北京,11