用于进行同源重组的方法、宿主细胞和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于进行同源重组的方法、宿主细胞和试剂盒，一种用于在共享至少一段同源序列的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，一种提高同源重组效率的方法。

Methods, host cells and kits for homologous recombination

The invention relates to a method for homologous recombination, a host cell and a kit, a method for homologous recombination between the first nucleic acid molecule and the second nucleic acid molecule sharing at least one homologous sequence, and a method for improving the efficiency of homologous recombination.

【技术实现步骤摘要】
用于进行同源重组的方法、宿主细胞和试剂盒本申请是2011年6月10日申请的PCT国际申请PCT/IB2011/052549于2013年2月6日进入中国国家阶段的、申请号为201180038908.6且专利技术名称为“直接克隆”的专利技术专利申请的分案申请。从DNA混合物如基因组DNA或cDNA制备物中克隆DNA片段的标准程序包括从蛋白、脂质以及其它污染物中纯化DNA，通常在限制性酶切后将该DNA制备物连接到克隆载体上以制备文库。由于文库通常为克隆DNA片段的复杂混合物，因此回收特定的DNA片段需要采用几种费力的方法之一来筛选文库。特定的DNA片段通常不是包含在单克隆中的，而是需要由两个或多个克隆重新构建或者伴随需要移除的不需要的侧翼序列(flankingsequence)。这些额外的亚克隆步骤使克隆的DNA文库方法更加费力。由于对人类疾病更加深入的了解，患者特定治疗方法的发展将变得更加普遍，包括患者特定基因修正方法的发展。理想地，患者特异基因修正可采用获得自患者的有问题的DNA区域，在实验室中修正并重新插入到患者体内。此外，下一代基因测序技术(例如454、Solexa或SOLiD4)的发展允许在不构建基因文库的情况下获得基因组序列数据。该方法称为“宏基因组学”，目前在没有伴随基因文库资源的情况下，已经了解了许多种类的大量的基因组序列数据，所述基因组序列数据在原核基因组的情况下可以是完整的。但是，功能研究需要获得并且操纵编码待研究的基因的克隆的DNA。因此需要一种新的技术以直接从基因组DNA池中将特定的DNA区域克隆到载体中，在本文中称为“直接克隆。”此外，在合成生物学中线性DNA片段组装的需求增加。这些线性DNA可以是ssDNA，优选寡核苷酸，或dsDNA。DNA片段的合成生物组装已用于产生基因、操纵子、染色体，并且最近用于产生整个基因组(参见参考文献42)。包括多于10个不同DNA分子的组装方法通常使用传统的DNA连接或由Red操纵子介导的同源重组或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞的内源性机制。因此开发一种按照确定的顺序组装DNA片段的新方法的需求增加。之前已描述过通过同源重组进行直接克隆和亚克隆，也称为“缺口修复克隆”或“线性到线性”(1-4)。术语“克隆”涉及一种通过连接于载体并在宿主细胞中增殖而从初始来源扩增DNA片段方法，所述宿主细胞通常为大肠杆菌(E.coli)或酵母。术语“亚克隆”涉及一种已经通过前述的克隆或PCR从初始来源扩增的DNA片段在宿主细胞中增殖的方法。除前述的直接克隆外，也描述了线性到线性同源重组的亚克隆应用(例如，参见克隆试剂盒PCRCloningKithttp://www.genscript.com/cloneez_PCR_Cloning_kit.html；或ColdFusionCloningKithttp://www.systembio.com/cold-fusion-cloning/)。目前通过同源重组进行亚克隆的方法不是很有效。但是，由于底物DNA片段在亚克隆之前基本上是纯的，因此并不需要高效。已经使用酵母实现了从基因组DNA制备物中直接克隆基因(8-12)。但是，该方法存在技术上的挑战，并且由于在酵母中重组不可控，因此克隆的DNA分子在基因方面通常不稳定。因此在酵母中进行直接克隆仅仅限制于实验室(V.Larionov-参见SelectiveisolationofmammaliangenesbyTARcloning.KouprinaN,LarionovV.CurrProtocHumGenet.2006May；Chapter5:Unit5.17)。之前将该酵母技术商业化的尝试失败了(Biotechcompany"Caliper"inBoston于2002年关闭)。由于表达rac噬菌体蛋白RecE和RceT，大肠杆菌sbcA菌株在线性到环状同源重组(在此处称为“LCHR”)中非常有效(5-7)。由于RecE和RecT与λ噬菌体蛋白中的Redα和Redβ同源，Redα和Redβ也显示可以介导非常有用和高效的同源重组。通过表达RecE/RecT或Redα/Redβ，线性到线性同源重组(在本文中称为“LLHR”)也大大增加。目前RecE/RecT介导的同源重组使用了截短形式的RecE。AJClark最初发现的RecE为279个氨基酸的5’到3’外切酶(RecE588)(参见文献5)。在5’端缺少14个氨基酸的较短形式(RecE602)也显示出LCHR和LLHR活性。该形式已经被结晶(Structure.2009May13；17(5):690-702.CrystalstructureofE.coliRecEproteinrevealsatoroidaltetramerforprocessingdouble-strandedDNAbreaks.)，并且与相似大小的5’到3’核酸外切酶Redα相当。这些RecE类型是原始的866个氨基酸长的rac噬菌体基因的截短形式。RecE的较短形式(RecE602)对应于最后的约265个氨基酸。换言之，与截短的RecE602相比，全长的RecE在其N-末端具有额外的601个氨基酸，而与截短的RecE588相比，全长的RecE在其N-末端具有额外的587个氨基酸。在大肠杆菌中，通过RecET介导的重组，DNA池中的基因可以通过一步反应克隆入线性载体中(7)。但是，该系统非常低效，不能常规的用于从基因组DNA制备物中直接克隆。特别的，它不能允许直接克隆随DNA池的复杂性而改变的超过一定大小的DNA片段。在复杂性较低的池中，如原核基因组DNA制备物，已有的技术允许直接克隆一些大于10kb的DNA区域。在复杂性较高的池中，如哺乳动物基因组DNA制备物，已有的技术仅允许以非常低的效率直接克隆短DNA区域(2kb左右)。本专利技术的一个目的是改进克隆方法。特别的，本专利技术的一个目的是提供一种直接克隆的方法，所述方法可以用作从DNA池中钓出感兴趣基因的方法。本专利技术的另一目的是提供一种改进的亚克隆方法。本专利技术的另一目的是提供改进的用于复杂DNA工程任务的方法，如将多个DNA片段组装成精确的产物。专利技术概述在第一个方面中，本专利技术提供一种在共享至少一个序列同源性区域的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，其中所述方法包括在5’到3’核酸外切酶和退火蛋白存在下，将第一核酸分子与第二核酸分子接触；其中，所述5’到3’核酸外切酶包括具有5’到3’核酸外切酶活性的区域并且至少：i)SEQIDNO:1的氨基酸564-587；或ii)24个氨基酸的序列，所述序列与SEQIDNO:1的第564-587位氨基酸在其24个氨基酸序列全长上具有至少70％的同一性。在第二个方面中，提供了一种在至少一个与经受同源重组的核酸分子无序列同源性的单链寡核苷酸存在的情况下进行同源重组而提高同源重组效率的方法，其中，与当所述至少一个单链DNA寡核苷酸不存在时进行同源重组相比，同源重组的效率提高了。在第三个方面中，提供了一种在共享至少一段序列同源性区域的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，包括在进行体内同源重组之前采用稀有切割序列特异性DNA切本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在共享至少一段序列同源区域的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，其中所述方法包括在5’到3’外切核酸酶和退火蛋白的存在下，将所述第一核酸分子与所述第二核酸分子接触；其中所述5’到3’外切核酸酶为RecE，其包含：a)具有5’到3’外切核酸酶活性的区域，其中所述区域包含SEQ ID NO:1的第588‑866位氨基酸或其变体或由SEQ ID NO:1的第588‑866位氨基酸或其变体组成，所述变体包含与SEQ ID NO:1的第588‑866位氨基酸在SEQ ID NO:1的第588‑866位氨基酸的长度上具有至少70％的同一性的序列或由其组成；和b)至少：i)SEQ ID NO:1的第564‑587位氨基酸；或ii)与SEQ ID NO:1的第564‑587位氨基酸在其24个氨基酸序列全长上具有至少70％同一性的24个氨基酸的序列，其中(b)部分中的所述序列紧邻具有5’到3’外切核酸酶活性的区域的N‑末端。

【技术特征摘要】
2010.06.10 GB 1009732.71.一种用于在共享至少一段序列同源区域的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，其中所述方法包括在5’到3’外切核酸酶和退火蛋白的存在下，将所述第一核酸分子与所述第二核酸分子接触；其中所述5’到3’外切核酸酶为RecE，其包含：a)具有5’到3’外切核酸酶活性的区域，其中所述区域包含SEQIDNO:1的第588-866位氨基酸或其变体或由SEQIDNO:1的第588-866位氨基酸或其变体组成，所述变体包含与SEQIDNO:1的第588-866位氨基酸在SEQIDNO:1的第588-866位氨基酸的长度上具有至少70％的同一性的序列或由其组成；和b)至少：i)SEQIDNO:1的第564-587位氨基酸；或ii)与SEQIDNO:1的第564-587位氨基酸在其24个氨基酸序列全长上具有至少70％同一性的24个氨基酸的序列，其中(b)部分中的所述序列紧邻具有5’到3’外切核酸酶活性的区域的N-末端。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RecE包含选自SEQIDNO:1的第1-866、141-866或564-866位氨基酸的序列或其变体或由选自SEQIDNO:1的第1-866、141-866或564-866位氨基酸的序列或其变体组成，其中所述变体与SEQIDNO:1在其序列全长上具有至少70％的序列同一性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述RecE与SEQIDNO:1中所提供的RecE具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RecE是全长RecE。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述退火蛋白是RecT。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是线性核酸分子。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述同源重组在宿主细胞内进行。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是由异源DNA表达的。9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是RecE并且是由整合的原噬菌体的RecE基因表达的，其中RecE的表达是由异源启动子驱动的。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶的表达是由诱导型启动子驱动的，所述诱导型启动子如阿拉伯糖诱导型启动子或鼠李糖诱导型启动子。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二核酸分子是线性化的克隆载体，如线性化的BAC、线性化的基于p15A起始区的载体、线性化的基于pBR322起始区的载体、线性化的粘粒、线性化的基于pUC起始区的载体或线性化的基于ColE1起始区的载体。12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是线性的，并且所述方法进一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和所述退火蛋白的存在下将第三核酸分子与所述第一和第二核酸分子接触，其中所述第一核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第三核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第二核酸分子与所述第一核酸分子共享一段同源区域并且与所述第三核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第三核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第一核酸分子共享一段不同的同源区域。13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是线性的，并且所述方法进一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和所述噬菌体退火蛋白的存在下将第三核酸分子和第四核酸分子与所述第一和第二核酸分子接触，其中所述第一核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第四核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第二核酸分子与所述第一核酸分子共享一段同源区域并且与所述第三核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第三核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第四核酸分子共享不同的同源区域，其中所述第四核酸分子与所述第三核酸分子共享一段同源区域并且与所述第一核酸分子共享一段不同的同源区域。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一核酸分子包含感兴趣的序列，所述第二和第四核酸分子是短的寡核苷酸，所述第三核酸分子是克隆载体。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子包含长度为2kb或更长的感兴趣的序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子包含的感兴趣的序列是基因簇。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述基因簇编码次级代谢产物途径或脂肪酸合成途径。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子是基因组DNA的片段。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子是线性化的BAC，所述方法用于将来自BAC的感兴趣的序列亚克隆至克隆载体中。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少第一和第二核酸分子是线性的，并且所述方法进一步包括在Redα和Redβ或截短的RecE和RecT的存在下，将所述至少第一和第二核酸分子之间的线性到线性同源重组反应的产物用于在线性到环状同源重组的第二步中，其中所述截短的RecE选自SEQIDNO:1的第588-866、595-866、602-866或606-866位氨基酸。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述线性到线性同源重组在全长RecE和RecT...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·张，J·付，F·斯图尔特，
申请(专利权)人：基因桥有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE