一种几丁质酶CmChi6基因及其克隆表达与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种几丁质酶CmChi6基因及其克隆表达与应用。本发明专利技术首次克隆出具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的外切几丁质酶CmChi6基因，并获得了高活性外切几丁质酶，其制备方法简单，生产成本低，产品易保存，适宜的酶解温度为45℃，酶解最适pH为7.4，在25‑50℃时热稳定性良好，33 h仍保持60%以上酶活；最适pH 7.4，在pH7.0‑10.0，33h酶活仍保持75％以上；Ba

Cloning, expression and application of a chitinase CmChi6 gene

The invention relates to a chitinase CmChi6 gene and its cloning, expression and application. The CmChi6 gene with nucleotide sequence as shown in SEQ ID No.1 has been cloned for the first time, and a highly active exo-chitinase has been obtained. The preparation method is simple, the production cost is low, the product is easy to preserve, the suitable enzymatic hydrolysis temperature is 45 C, the optimum pH is 7.4, the thermal stability is good at 25 50 C, and the enzyme activity is still over 60% for 33 h; the optimum pH is 7.4, at P. H7.0 10.0, the enzyme activity remained above 75% at 33h;

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质酶CmChi6基因及其克隆表达与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种几丁质酶CmChi6基因及其克隆表达与应用。
技术介绍
几丁质（Chitin）：又称甲壳素、甲壳质、壳蛋白、壳多糖、明角质等，是一种含氮的多糖物，是自然界第二大丰富的生物聚合物，分布十分广泛，是许多低等动物特别是节肢动物如虾、蟹、昆虫等外壳的重要成分，也是低等植物菌类细胞膜的组成部分，地衣，绿藻、酵母、水母及乌贼体内也含有。据估计每年的生物合成量超过100亿吨，是一种巨大的可再生资源。几丁质是由单体N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚体，分子量大多在100万以上。几丁质的降解产物是高附加值的几丁寡糖、几丁单糖及相应衍生物等，都具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、降血压和降低固醇及美容等功效，广泛应用于医药、农业、工业和食品等众多领域。目前。几丁质制备几丁寡糖主要为酸水解法。酸水解法常利用浓酸可将几丁质降解为氨基葡萄糖，经乙酰化后获得N-乙酰氨基葡萄糖；或利用稀酸降解几丁质获得几丁寡糖。但此方法工艺耗能大，产品得率低、产品生物活性差。尤其是污染严重问题突出，因此工业生产急需一种绿色、环保、高效高产高品质的降解几丁质方法。几丁质酶（Chitinase，EC3.2.1.14）：是一种糖苷水解酶，细菌，真菌，植物及低等动物均能产生。一般来说它是一个酶系，包含多种同工酶。按切割糖苷键的方式的不同可分为外切几丁质酶，内切几丁质酶及N-乙酰葡萄糖苷酶。外切几丁质酶从几丁质糖链非还原末端将几丁质降解为（GlcNAc）2,内切几丁质酶与外切几丁质酶有所不同，其可随机作用于几丁质长链的任何一个糖苷键，并将其水解成几丁寡糖；而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶不能作用于几丁质，只能水解几丁寡糖为单糖GlcNAc。几丁质酶这种将几丁质降解为几丁寡糖或单糖，反应条件温和，环保绿色，无污染物生成，且原料及成本投入较低的特性，可满足工业化低成本和高产量的需要。因此，通过发掘具有极高价值的催化能力的几丁质酶对于降解几丁质资源具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种几丁质酶Cmchi6基因及其克隆表达与应用。该基因来源于菌种ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBC-H1（ATCCBAA-2140T），重组几丁质酶CmChi6酶活较高，可达1.00±0.05U。该酶的最适温度45℃，在25-50℃时热稳定性良好，33h仍保持60%以上酶活；最适pH7.4，在pH7.0-10.0，33h酶活仍保持75％以上，表明CmChi6稳定性较高；Ba2+对CmChi6活力具有微弱的激活作用；CmChi6水解胶体几丁质产物主要为（GlcNAc）2，伴有少量GlcNAc；水解寡糖模式为典型的外切酶。为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种几丁质酶CmChi6基因，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。一种几丁质酶CmChi6基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。一种重组表达载体，含有所述的编码所述的几丁质酶CmChi6基因的核苷酸序列的重组表达载体。一种基因工程化的宿主细胞，所述的基因工程化的宿主细胞转化了如上所述的的重组表达载体。上述几丁质酶CmChi6基因的克隆表达，包括以下步骤：步骤1，PCR扩增SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；步骤2，构建质粒载体如pColdI-Cmchi6将PCR扩增的DNA序列和pColdI载体用同样的限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切，用T4DNA连接酶连接酶切回收的纯化的酶切产物，得到质粒载体pCooldI-Cmchi6；步骤3，构建克隆菌株pColdI-Cmchi6-E.coliTrans1T1将质粒载体pColdI-Cmchi6转化至E.coliTrans1T1，得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标菌株；步骤4，构建表达菌株pColdI-Cmchi6-BL21(DE3)将克隆菌株pColdI-Cmchi6-E.coliTrans1T1提取出来的质粒转化至E.coliBL21(DE3)，挑选阳性转化子直接克隆培养，得到重组表达菌株pColdI-Cmchi6-BL21(DE3)；步骤5，体外诱导表达将重组表达菌株pCooldI-Cmchi6-BL21(DE3)接入5ml含氨苄霉素的LB培养基中，于25-40℃过夜培养10-20h后，按1%的接种量接种到100ml含氨苄霉素的LB培养基中，当OD600=0.4-0.6，加入终浓度为0.5mM-1mM的IPTG，于16-25℃，150-250rpm低温诱导20-24h；步骤6，几丁质酶获得体外诱导表达结束后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎，每次10-15min，超声2秒间隔3秒，然后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集上清液，即得粗酶液CmChi6。作为改进的是，粗酶液的纯化利用超声过的纯水、50mM和500mM的咪唑先后清洗蛋白纯化仪管路及镍柱，去除其中的杂质。将经过离心5-10min，取上清过滤已去除杂质和破碎细胞的粗酶液上柱。接着用50mM的咪唑打通管路，目标蛋白具有His标签，因此可吸附在镍柱上，不带His标签的杂蛋白以及其它杂质不能吸附在镍柱上从而被冲洗下来，待目标蛋白都吸附在镍柱上后，换用500mM的咪唑洗脱目标蛋白，此时注意收集目标蛋白，将最后收集得到的目标蛋白取样进行8％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图1，获得纯化CmChi6酶液。作为改进的是，步骤1中PCR扩增所用的引物为上游引物Chi-F：5’-CATATGATGGCCTTGTTGCCGTTGG-3’，下游引物：Chi-R：5’-CCCAAGCTTCTACTTTGCCGCCGGAAT-3’。上述几丁质酶CmChi6在酶解含胶体几丁质底物中的应用。作为改进的是，所述应用中酶解温度为45℃，pH值为7.4，在25-50℃时热稳定性良好，33h仍保持60%以上酶活；在pH7.0-10.0，33h酶活仍保持75％以上，表明CmChi6稳定性较高。作为改进的是，所述含胶体几丁质底物可改为几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖和几丁六糖。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优势在于：1、本专利技术获得了几丁质酶CmChi6基因的核苷酸序列，该序列首次从ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBC-H1（ATCCBAA-2140T）中克隆，其核酸序列与来自UncluturedbacteriumgeneST35的几丁质酶基因序列相似度仅为2.48%，其氨基酸序列与Chitiniphilusshinanonensis中的糖苷水解酶GH18几丁质酶的相似率也仅为76.69%，因此其一级结构新颖。且成本低廉，分子水平操作简单，易于克隆表达，重复性较好，在工业中具有潜在应用价值；2、本专利技术构建了几丁质酶CmChi6原核表达载体，成功获得分子量约为40kD的酶蛋白，蛋白表达效果好，酶活高，且制备过程简单，为CmChi6功能研究提供了简便方法；3、本专利技术中几丁质酶在25-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种几丁质酶

【技术特征摘要】
1.一种几丁质酶CmChi6基因，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。2.根据权利要求1所述的几丁质酶CmChi6基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.一种重组表达载体，含有所述的编码几丁质酶CmChi6基因的核苷酸序列的重组表达载体。4.一种基因工程化的宿主细胞，所述的基因工程化的宿主细胞转化了如上所述的的重组表达载体。5.基于权利要求1述的几丁质酶CmChi6基因的克隆表达，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，PCR扩增SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；步骤2，构建大肠杆菌质粒载体pColdI-Cmchi6将PCR扩增的DNA序列和pColdI载体用同样的限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接，得到质粒载体pCooldI-Cmchi6；步骤3，构建大肠杆菌克隆菌株pColdI-Cmchi6-E.coliTrans1T1将质粒载体pColdI-Cmchi6转化至E.coliTrans1T1，得到阳性转化子，经筛选并测序确定为目标菌株；步骤4，构建大肠杆菌表达菌株pColdI-Cmchi6-BL21(DE3)将克隆菌株pColdI-Cmchi6-E.coliTrans1T1提取出来的质粒转化至E.coliBL21(DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株pColdI-Cmchi6-BL21(DE3)；步骤5，体外诱导表达将重组表达菌株pCooldI-Cmchi6-BL21(DE3)接入5ml含氨苄霉素的摇管L...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，王莹莹，张阿磊，莫晓芳，周宁，杨赛，魏衍鹏，曹飞，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32