一种制备纤维素酶的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体是一种制备纤维素酶的方法。所述方法采用枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌混合发酵；将枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌分别接种至PDA培养基，培养2‑5天后，接种至以小麦麸皮为碳源的发酵培养基进行混合发酵；枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的比例为10‑115:5‑8:15‑20。本发明专利技术方法将枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵，不仅能够显著缩短发酵时间，而且能够显著提高纤维素酶活力，以小麦麸皮为碳源，原料易得、成本低廉，绿色环保。

A Method for Preparing Cellulase

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for preparing cellulase. The method adopts the mixed fermentation of Bacillus subtilis, Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus subtilis, Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens are inoculated into PDA medium respectively, after 2 to 5 days of culture, inoculated into the fermentation medium with wheat bran as carbon source for mixed fermentation; the proportion of Bacillus subtilis, Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens It is 10 115:5 8:15 20. The method of the invention not only can significantly shorten the fermentation time, but also can significantly improve the cellulase activity by mixed fermentation of Bacillus subtilis, Bacillus-like bacteria and Bacillus amylolytica. The wheat bran is used as carbon source, the raw material is easy to obtain, the cost is low, and the environment is green.

【技术实现步骤摘要】
一种制备纤维素酶的方法
本专利技术涉及生物
，具体是一种制备纤维素酶的方法。
技术介绍
随着经济的发展，人类对石油、天然气、煤炭等不可再生化石能源的需求越来越大，由此产生了能源安全、石油消耗、全球变暖等诸多问题。这些问题促使世界各国加快了对安全、清洁、可再生的替代能源的研究。燃料乙醇是当前研究和应用都取得很大进展的一种清洁的可替代能源，但目前其生产主要依赖于淀粉和糖类原料，这两种原料利用涉及到与人畜争粮争地的问题，由此带来的粮食价格上涨问题已经显现。开发粮食以外的廉价原料对制取燃料乙醇技术意义重大。木质纤维素原料生产燃料乙醇的工艺流程主要包括预处理、纤维素酶水解以及发酵菌种和发酵工艺三步。纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖。纤维素酶广泛的应用于食品加工业、酿造业、造纸工业、饲料添加剂、纺织工业、医药领域、植物细胞融合等方面。纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。目前传统工艺均采用单种菌株发酵产纤维素酶，酶活力较低，发酵生产时间过长。小麦是单子叶植物，是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，小麦的颖果是人类的主食之一。小麦广泛种植于我国东部和北部地区。中国是世界最早种植小麦的国家之一。2010年小麦是世界上总产量位居第二的粮食作物(6.51亿吨)，仅次于玉米(8.44亿吨)。麦麸，即麦皮，小麦加工面粉副产品，麦黄色，片状或粉状。麦皮的端部有部分胚芽(也就是麦子生芽的部位)，大约占麦皮总量的5-10％左右，麦皮共分6层，外面的5层含粗纤维较多，营养少，难以消化。麦皮含有大量的维生素B类，富含纤维素和维生素。麦麸多数当作饲料应用，若能有效利用麦麸，变废为宝，有利于可持续发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以廉价碳源—小麦麸皮为原料，通过菌种的协同效应制备纤维素酶的方法，能够在较短的时间内获得较高的纤维素酶活力。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种制备纤维素酶的方法，所述方法采用枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌混合发酵。上述一种制备纤维素酶的方法，所述方法将枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌分别接种至PDA培养基，培养2-5天后，接种至以小麦麸皮为碳源的发酵培养基进行混合发酵。可选的，所述枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的比例为10-115:5-8:15-20。可选的，所述发酵培养基含有如下成分：小麦麸皮15g/L，蛋白胨2.0g/L，(NH4)2SO42.5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，pH6.0。可选的，所述发酵温度为25-35℃，发酵时间67-77h。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术方法将枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵，不仅能够显著缩短发酵时间，而且能够显著提高纤维素酶活力。三种菌株混合发酵后，产生的纤维素酶活性大于各菌株单独发酵产生的纤维素酶活性之和，即三种菌株混合发酵产生了协同增效作用；另外，采用本专利技术方法制备高活性纤维素酶，由于碳源是小麦麸皮，原料易得、成本低廉，减少了小麦麸皮焚烧带来的环境污染，且发酵过程对环境无污染，具有广阔的市场前景；采用本专利技术方法制备的纤维素酶，最适反应温度为60度，而且在该温度下酶活力稳定，应用于水解秸秆，耗时短，葡萄糖含量高。附图说明图1本专利技术方法制备的纤维素酶的最适反应pH图；图2本专利技术方法制备的纤维素酶的最适反应温度图。具体实施方式实施例1采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、类芽孢杆菌(Bacilluscellulosilyticus)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)发酵制备纤维素酶。1.菌株来源所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacilluscellulosilyticus)，保藏号为CGMCC1.15312；可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买得到。所述产纤维素酶枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏号为CGMCC1.821；可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买得到。所述产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC1.857；可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买得到。2.种子液的获得种子液的获得：将枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌分别接种于PDA培养基(每升培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)上，30℃培养3d。用生理盐水分别洗下各菌株的孢子，将各菌株的孢子悬液混合得到了种子液。种子液中，所有菌株的集落形成单位数目为1×107CFU/ml，其中枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌集落形成单位数目之比为20:5:15。3.制备纤维素酶发酵培养基含有如下成分：小麦麸皮15g/L，蛋白胨2.0g/L，(NH4)2SO42.5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，pH6.0。采用本专利技术方法制备纤维素酶，包括如下步骤：将1ml种子液接种至100ml发酵培养基中，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液作为纤维素酶液。检测纤维素酶液的活力(滤纸酶活力)，结果见表1。滤纸酶活力(FPA)按照国际理论和应用化学协会推荐的标准方法测定(GhoseTK.Measurementofcellulaseactivities.Pure&Appl.chem.,1987,59(2):257～268),以国际单位(IU)表示。一个国际滤纸酶活力单位(IU)等于酶水解反应中每分钟由滤纸(WhatmanNo.1)生成1μmol葡萄糖的酶量。对比试验1：将1ml的枯草芽孢杆菌孢子悬液(集落形成单位数目为5×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。对比试验2：将1ml的类芽孢杆菌孢子悬液(集落形成单位数目为1.25×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。对比试验3：将1ml的解淀粉芽孢杆菌孢子悬液(集落形成单位数目为3.75×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。对比试验4：将1ml的枯草芽孢杆菌和类芽孢杆菌孢子悬液(集落形成单位数目分别为5×106CFU/ml和1.25×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法采用枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌混合发酵。

【技术特征摘要】
1.一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法采用枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌混合发酵。2.如权利要求1所述的一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法将枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌分别接种至PDA培养基，培养2-5天后，接种至以小麦麸皮为碳源的发酵培养基进行混合发酵。3.如权利要求1或2所述的一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的比...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，迟乃玉，王泽坤，姜南，于爽，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21