一种源于知母的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够特异催化呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的蛋白，AaF26G1，为β‑葡萄糖苷酶的一种。通过设计特定的引物，可从中药知母植物中克隆得到该蛋白的编码基因；利用生物工程的方法，可进一步制备得到含有该蛋白表达基因的表达载体、重组细胞系。通过将上述重组细胞进行扩大培养及诱导表达，可裂解得到该蛋白的粗酶，进一步纯化可得到精酶，所得到的酶可在体外将具有一定结构特征的呋甾皂苷转化为螺甾皂苷。本发明专利技术提供的方法能在体外高效转化呋甾皂苷为螺甾皂苷，相比传统的转化方法可控性更好，效率更高，对制备改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等多种含螺甾皂苷的药物具有重要的应用价值。

A beta-glucosidase derived from Anemarrhena asphodeloides, its coding gene, expression vector and its application

The invention discloses a protein, AaF26G1, which can specifically catalyze the conversion of furosemide saponins to spirosterone saponins, and is a kind of beta-glucosidase. By designing specific primers, the encoding gene of the protein can be cloned from Anemarrhena asphodeloides, and the expression vector and recombinant cell line containing the protein can be further prepared by bioengineering method. The crude enzymes of the protein can be obtained by enlarging culture and inducing expression of the recombinant cells. Spermase can be further purified. The obtained enzymes can convert furostatin saponins with certain structural characteristics into spirosaponins in vitro. The method provided by the invention can efficiently transform furostanol saponins into spirosteroid saponins in vitro, and has better controllability and higher efficiency than the traditional transformation method. It has important application value for preparing spirosteroid saponins containing drugs such as improving dementia symptoms, anti-aging, anti-depression, anti-cancer and so on.

【技术实现步骤摘要】
一种源于知母的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、表达载体及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种蛋白，具体涉及一种能够转化呋甾皂苷为螺甾皂苷的β-葡萄糖苷酶。
技术介绍
甾体皂苷(Steroidalsaponins)是一类重要的中药活性成分，是合成甾体激素及其有关药物的重要原料。在植物中有着广泛的分布，主要存在于百合科、薯蓣科、菝葜科、玄参科、龙舌兰科等植物中，迄今发现此类化合物已达万种以上。甾体皂苷具有抗癌、治疗心血管疾病、调节免疫等多方面的生理活性。至今为止，全球生产的甾体药物高达400多种，其包括甾体激素类、甾体生物碱、强心苷类、甾体皂苷类等。近年来，随着甾体生物转化技术的不断发展，甾体药物被广泛应用于治疗风湿、心血管、胶原性疾病、淋巴性白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调等疾病。据统计，2011年甾体激素药物销售额就已高于280亿美元，约占全球医药总销售额的6％，成为产量第二大类药物，仅次于抗生素。螺甾皂苷具有较好的药效活性。甾体皂苷依据F环的环合状态分为呋甾皂苷(Furostanolsaponin)和螺甾皂苷(Spirostanolsaponin)两种类型。螺甾皂苷甾体皂苷元的结构特征之一就在于E/F的螺环，此螺环半开环可以得到呋甾烷型化合物，全开环则可以得到胆甾烷型化合物。螺甾烷醇苷类具有典型的皂苷性质，如抗真菌、溶血活性，被认为是许多中药的有效成分，一直受到国内外科研工作者的普遍重视；而呋甾皂苷类活性较弱，俄国学者曾进行了甾体皂苷类化合物降胆固醇作用的筛选工作，发现螺甾皂苷类的活性远远高于呋甾皂苷类的活性，后者几乎无降胆固醇作用。螺甾烷型甾体皂苷元是天然产物中一类非常重要的生物活性物质，比如薯蓣皂苷元，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗高血脂、抗病毒等作用；知母皂苷及其苷元在改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等方面有着显著作用。F26G(Furostanolglycoside26-O-β-glucosidase)存在于植物体内，为一种β-葡萄糖苷酶，由于它能特异的切开呋甾烷型皂苷C26位的葡萄糖，所以称这个酶为F26G。植物的根茎通常贮存呋甾皂苷，当植物受到损伤或者虫咬时，会释放F26G，生成活性更高的螺甾皂苷，螺甾皂苷的抗虫活性强于呋甾皂苷。因此，呋甾皂苷和螺甾皂苷之间的转化反应是由F26G所催化的，该酶一直被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个关键酶，该酶不同于普通的β-葡萄糖苷酶，有很强的专一性。目前从植物中克隆的F26G基因较少，仅从甘薯和闭鞘姜植物中克隆了F26G。知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)是重要的常用中药，甾体皂苷在知母根茎中的总含量非常高，约为6％，近50多种不同的呋甾皂苷和螺甾皂苷。近年来，发现知母甾体皂苷具有治疗老年痴呆的作用，知母皂苷BⅡ作为国家I类新药研发。目前虽然存在酶转化法，主要从猪肝脏、微生物中分离纯化出关键的糖苷酶，或者利用基因重组技术获得高活性的重组酶。知母皂苷BⅡ是呋甾皂苷，在知母根茎中含量最高。因此，从知母原植物中克隆合适F26G，将呋甾皂苷转化为活性更强的螺甾皂苷，具有重要的应用价值。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是，提供一种可在体外将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的蛋白。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种蛋白，为β-葡萄糖苷酶的一种，命名为AaF26G1，源于中药知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)，能够将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷。所述蛋白的氨基酸序列为a)或b)：a)如序列表SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；b)序列表SEQIDNO：1中的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且编码与所述蛋白相关的衍生蛋白的氨基酸序列。序列表中的序列1由633个氨基酸残基组成。取代和/或缺失和/或添加具体可为1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述(b)中的AaF26G1可以人工合成，也可以是重组蛋白、天然蛋白，也可以先合成其编码基因，在进行生物表达得到。上述(b)中的AaF26G1的编码基因可通过将序列表序列1，自5’端第一至1650位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在5’端和/或在3’端连上纯化标签得到。所述蛋白的编码基因的核苷酸序列为1)或2)或3)：1)如序列SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；2)与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白的核苷酸序列；3)与1)或2)限定的序列具有90％以上同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。根据所述蛋白的编码基因，可通过设计特定的引物对在知母的基因组中扩增得到。经过生物工程的方法，可将扩增得到的基因插入到特定的载体/细胞，构建含有所述蛋白基因组的重组表达载体、表达盒。优选地，所述重组表达载体为pColdI-AaF26G1：将所述基因AaF26G1连接到pColdI载体上。将所述基因AaF26G1连接到pColdI或pColdTF载体，研究发现pColdTF载体表达TF蛋白与目的蛋白结合，后期对酶活有影响，并且相比于该pColdI载体，pColdTF载体没有明显促进可溶性目的蛋白的表达；由于pColdI载体克隆位点处有His标签与目的蛋白连接，可利用TAKARA公司的His60NiGravityColumns对表达的带His标签的AaF26G1进行纯化，因此优选pColdI为重组表达出发载体。将含有所述蛋白的编码基因的重组表达载体转入生物细胞中，即可得到转基因细胞系或重组菌，可用于表达所述蛋白。重组时用到的生物细胞包括原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)。一般选用大肠杆菌(E.Coli)进行重组蛋白的原核表达。优选地，使用大肠杆菌BL21(pGro7)为原核表达菌。通过在http://www.biotech.ou.edu/网站计算，当在大肠杆菌中过表达时，该AaF26G1蛋白溶解率为0。前期选用不同菌种(包括E.ColiDH5α、BL21、BL21(pGro7))做过表达时，仅E.ColiBL21(pGro7)菌种表达可溶性蛋白。pGro7可表达分子伴侣，可促进可溶性目的基因蛋白的表达。本专利技术还提供生产所述蛋白的方法：将含有所述蛋白编码基因的转基因细胞系或重组菌扩大培养，并诱导表达所述蛋白，破碎(裂解)细胞(菌)体可得到含有所述蛋白粗酶，或对粗酶经进一步纯化后可得到精酶(即纯酶)。所得到的酶可用于在体外将呋甾皂苷为螺甾皂苷。具体地，所述蛋白将呋甾皂苷转化为螺甾皂苷的具体表现为：对C3、C26位连有双糖链的，且呋甾皂苷C22有易于游离的羟基或甲氧基等基团，或C22位存在双键的呋甾体皂苷有效。本专利技术提供的蛋白能够利用生物工程的方法在体外将呋甾皂苷为螺甾皂苷，相比传统的转化方法可控性更好，效率更高，对制备改善老年痴呆症状、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤等含有螺甾皂苷的药物具有重要的应用价值。附图说明图1为AaF26G1基因扩增产物的电泳图。图2为pColdI-AaF26G1的重组质粒结构图谱。图3为pColdI-AaF26G1在大肠杆菌中表达的聚丙烯酰胺电泳图及纯化后的AaF26G1蛋白。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白，名为AaF26G1，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为a)或b)：a)如序列SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；b)序列SEQ ID NO：1中的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，编码与所述蛋白相关的衍生蛋白的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，名为AaF26G1，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为a)或b)：a)如序列SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；b)序列SEQIDNO：1中的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，编码与所述蛋白相关的衍生蛋白的氨基酸序列。2.如权利要求1所述蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为1)或2)或3)：1)如序列SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；2)与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白的核苷酸序列；3)与1)或2)限定的序列具有90％以上同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。3.用于扩增权利要求2所述编码基因的引物对，序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。4.含有如权利要求2所述编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.如权利要求4所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：段礼新，刘中秋，王丽君，梁锦才，季爱加，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44