一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法技术

本发明专利技术公开了一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法。本发明专利技术包括以下步骤：首先使用碱性蛋白酶酶解脱脂林蛙卵粉制备林蛙卵蛋白水解液，之后制备菌体的冻干保护剂，主要包括猴头菇提取物15％‑20％，林蛙卵蛋白水解物10％‑20％，海藻糖15％‑25％，抗坏血酸3％‑5％。将培养离心获得的罗伊氏乳杆菌菌体加入到配制好且除菌后的冻干保护剂中混匀，其中菌体与保护剂的体积质量比为1：1‑10，最终将混匀后的菌悬液真空冷冻干燥。使用该冻干保护剂，罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的存活率在70％以上。

A Method for Protecting Lactobacillus Roy from Frog Ovalbumin Hydrolysate by Freeze-drying

The invention discloses a freeze-drying protection method for Lactobacillus Roy by frog egg protein hydrolysate. The invention comprises the following steps: firstly, defatted frog egg powder is hydrolyzed by alkaline protease to prepare frog egg protein hydrolysate, and then freeze-drying protectant is prepared, which mainly includes 15%-20% of Hericium erinaceus extract, 10%-20% of frog egg protein hydrolysate, 15%-25% of trehalose and 3%-5% of ascorbic acid. The Lactobacillus Roy cultured by centrifugation was added into the prepared and sterilized freeze-drying protectant, in which the volume-mass ratio of Lactobacillus Roy to protectant was 1:1_10, and finally the mixed suspension was vacuum freeze-dried. With this freeze-drying protectant, the survival rate of Lactobacillus royi freeze-drying powder was more than 70%.

【技术实现步骤摘要】
一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法
本专利技术涉及微生物发酵领域,具体涉及一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法。
技术介绍
罗伊氏乳杆菌存在于大多数脊椎动物和哺乳动物的肠道中，可以定植于肠道内部抑制其他有害菌的生长。本专利选取的罗伊氏乳杆菌属于太空诱变菌株，经研究后表明该菌株的抗冻性以及贮藏过程中稳定性较差，但具有保护胃黏膜、调节肠道菌群以及抗炎抗过敏的作用，目前在婴幼儿和成人保健食品、功能性固体饮料以及营养食品中均有应用。林蛙可以在寒冷冬天保持卵子的活性，表明林蛙卵具有一定的抗冻功能，同时也有研究表明林蛙卵蛋白具有抗疲劳的功能。对林蛙卵粉进行酶解制备林蛙卵蛋白水解物，可以起到对菌体保护和提高其营养价值的双重作用。猴头菇是一种药膳兼用菌，猴头菇多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等多种生理功能，对人体具有良好的保健功能。目前主要通过真空冷冻干燥的方法制备乳酸菌菌粉，真空冷冻干燥技术可以降低酶的活性和菌体的死亡率，充分去除菌体中的水分便于菌粉的运输和保存。但冻干会破坏菌体的细胞膜和磷脂分子层从而导致菌体死亡。菌种的冻干保护剂可以降低冻干过程对菌体的伤害，通过与磷脂双分子层或者膜蛋白的结合弱化冰晶对菌体的破坏，也可以通过转变膜脂质等成分的相转变温度来抑制冰晶的形成。目前益生菌的适用的冻干保护剂主要有蛋白质类、糖类、醇类、氨基酸、抗坏血酸等，但目前还未能检索到使用林蛙卵蛋白水解物和真菌提取物作为保护剂的文献。本专利使用林蛙卵蛋白水解物和猴头菇提取物作为罗伊氏乳杆菌的冻干保护剂，对罗伊氏乳杆菌太空诱变菌株具有较好的保护作用，并同时提高了其在贮藏过程中的稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法。本专利技术能有效提高罗伊氏乳杆菌冻干后的存活率和贮藏稳定性。本专利技术第一方面提供了一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法，主要包括以下组分：猴头菇提取物，林蛙卵蛋白水解物，海藻糖，抗坏血酸。在本专利技术的一实施方案中,所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂包括以下重量百分比的成分：猴头菇提取物15％-20％，林蛙卵蛋白水解物10％-20％，海藻糖15％-25％，抗坏血酸3％-5％。优选的所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂，包括以下组分：猴头菇提取物20％，林蛙卵蛋白水解物15％，海藻糖20％，抗坏血酸3％。本专利技术第二方面提供了一种罗伊氏乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：(1)称取一定量的脱脂林蛙卵粉，按料液比1：5加入蒸馏水，使用1mol/L的NaOH调节pH至9后加入2％的碱性蛋白酶，置于58℃的水浴锅搅拌4h。酶解结束后升温至100℃灭酶5min，过滤残渣得到滤液，用1mol/L的HCl调节滤液pH至中性，7000r/min10min对滤液进行离心分离，离心后的上清液置于真空冷冻干燥机中干燥24h得到林蛙卵蛋白水解物。(2)按照配比称取各组分配制冻干保护剂将称好的猴头菇提取物、林蛙卵蛋白水解物、海藻糖、抗坏血酸充分溶解于pH＝6.5的磷酸盐缓冲液中，使用微滤膜除菌，备用。在本专利技术的一实施方案中,所述冻干保护制备方法步骤中，pH＝6.5的磷酸盐缓冲液为4℃。在本专利技术的一实施方案中,所述冻干保护制备方法步骤中，微滤膜的孔径为0.2μm。本专利技术第三方面提供了如权利1要求所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂、如权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂的制备方法在制备罗伊氏乳杆菌冻干菌粉中的应用。在本专利技术的一实施方案中,所述的罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的制备包括以下步骤：将罗伊氏乳杆菌活化、培养，离心得到菌泥，按照菌泥与冻干保护剂1：1-10的重量体积比加入冻干保护剂混合均匀，真空冷冻干燥，得到罗伊氏乳杆菌冻干菌粉。优选的，所述菌体与保护剂的质量体积比为1：8。下面结合具体实例对本专利技术进行详尽的描述，应当指出，本专利技术是范例性的，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本专利技术原理和范围的条件下对本专利技术技术方案的细节和进行修改或者替换，这些修改和替换也视为本专利技术的保护范围。本专利技术中无特殊说明的试剂和设备都源于市售。本专利技术提供的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂，主要包括以下组分：按菌泥质量8倍的体积数配制保护剂，其中猴头菇提取物15％-20％，林蛙卵蛋白水解物10％-20％，海藻糖15％-25％，抗坏血酸3％-5％。本专利技术提供的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂，其方法主要包括以下步骤：将称好的猴头菇提取物、林蛙卵蛋白水解物、海藻糖、抗坏血酸充分溶解于pH＝6.5的磷酸盐缓冲液中，使用0.2μm微滤膜除菌，备用。离心后的菌泥按照质量体积比1:8与冻干保护剂混合均匀，用于罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的制备。具体实施方式实施例11、罗伊氏乳杆菌的培养(1)从-80℃的冰箱里取出冻存的罗伊氏乳杆菌(来自于实验室的太空诱变菌种罗伊氏乳杆菌F-9-35)，以2％的比例里接种于5ml的MRS培养基中，37℃恒温箱培养12h。(2)将活化后的罗伊氏乳杆菌F-9-35平板划线，37℃恒温箱培养20h。(3)挑取平板划线后的单菌落接种于5ml的MRS培养基中，37℃恒温箱培养12h。(4)以3％的比例将步骤(3)中的菌液接种于100ml的MRS培养基中，37℃恒温箱培养10h。(5)以3％的比例将步骤(4)中的菌液接种于900ml的MRS培养基中，37℃恒温箱培养10h。2、罗伊氏乳杆菌保护剂的配制(1)将15g猴头菇提取物、10g林蛙卵蛋白水解物、20g海藻糖、3g抗坏血酸充分溶解于100ml4℃pH＝6.5的磷酸亚缓冲液中，使用0.2μm微滤膜过滤除菌，备用。3、菌体与保护剂的混合(1)将步骤1中的900ml菌液均分在6个离心瓶中，调整参数：转速为6000g，时间为10min，温度为4℃。(2)离心结束后将培养基倒出，按照菌体质量8倍的体积数加入15％猴头菇提取物、10％林蛙卵蛋白水解物、20％海藻糖、3％抗坏血酸的混合溶液，混合均匀得到菌悬液，吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释，选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数，每个梯度三个平板，记为初始菌数N0。3、真空冷冻干燥吸取1ml菌悬液于冻干瓶中，厚度约为0.8cm，将冻干瓶置于-80℃条件下预冻1h，之后将其放入冻干机中真空冷冻干燥24h，冻干后的菌粉加入与冻干前等体积的纯化水复溶，之后吸取一定量的菌液使用生理盐水进行梯度稀释，选择10-6、10-7、10-8三个稀释梯度涂布平板划线计算菌数，每个梯度三个平板，记为初始菌数N1。4、冻干结果冻干存活率＝N0/N1(N0和N1的单位均为cfu/ml)冻干前的菌数N0＝1.74*1010，冻干后的菌数N1＝1.09*1010，罗伊氏乳杆菌的存活率为62.6％。实施例21、罗伊氏乳杆菌的培养(1)从-80℃的冰箱里取出冻存的罗伊氏乳杆菌(来自于实验室的太空诱变菌种罗伊氏乳杆菌F-9-35)，以2％的比例里接种于5ml的MRS培养基中，37℃恒温箱培养12h。(2)将活化后的罗伊氏乳杆菌F-9-35平板划线，37℃恒温箱培养20h。(3)挑取平板划线后的单菌落接种于5ml的MRS培养基中，37℃恒温箱培养12h。(4)以3％的比例将步骤(3)中的菌液接种于100ml的MRS培养基中，37℃恒温箱培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法，其特征在于，包括以下组分：猴头菇提取物，林蛙卵蛋白水解物，海藻糖，抗坏血酸。

【技术特征摘要】
1.一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法，其特征在于，包括以下组分：猴头菇提取物，林蛙卵蛋白水解物，海藻糖，抗坏血酸。2.如权利要求1所述的林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的方法，其特征在于，包括以下重量百分比：猴头菇提取物15％-20％，林蛙卵蛋白水解物10％-20％，海藻糖15％-25％，抗坏血酸3％-5％。3.一种林蛙卵蛋白水解物对罗伊氏乳杆菌冻干保护的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)称取一定量的脱脂林蛙卵粉，按料液比1：5加入蒸馏水，使用1mol/L的NaOH调节pH至9后加入2％的碱性蛋白酶，置于58℃的水浴锅搅拌4h；酶解结束后升温至100℃灭酶5min，过滤残渣得到滤液，用1mol/L的HCl调节滤液pH至中性，7000r/min10min...

【专利技术属性】
技术研发人员：张铁华，赵禹彤，费付喜，李乐，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22