一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用制造技术

一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用，本发明专利技术之杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌，为苏云金芽胞杆菌ΔleuB，该菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019112。本发明专利技术利用I‑SceI介导的基因无痕敲除系统对苏云金芽胞杆菌Bt 4.0718基因组中的leuB基因成功进行敲除，得到一株苏云金芽胞杆菌突变菌株，ΔleuB突变株表型变化明显：在LB液体培养基中无成熟芽胞、晶体蛋白合成量增加且母细胞不裂、晶体蛋白被包裹形成微包囊；突变菌对小菜蛾杀虫活性较野生菌有提高，差异较显著。

A Bacillus thuringiensis with good insecticidal performance and environmental safety and its application

A Bacillus thuringiensis with good insecticidal performance and environmental safety and its application. The Bacillus thuringiensis with good insecticidal performance and environmental safety is Bacillus thuringiensis leuB. The preservation number of the bacterium is CCTCC NO:M 2019112. The invention successfully knocks out the leuB gene in the genome of Bacillus thuringiensis Bt 4.0718 by using the I SceI-mediated gene traceless knockout system, and obtains a Bacillus thuringiensis mutant strain. The phenotype of leuB mutant strain has obvious changes: there are no mature spores, the amount of crystal protein synthesis increases in the LB liquid medium, and the mother cell does not split, and the crystal protein is encapsulated into microcapsules; The insecticidal activity of mutant fungi to Plutella xylostella was higher than that of wild fungi, and the difference was significant.

【技术实现步骤摘要】
一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用
本专利技术涉及一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用，尤其是涉及一株不产芽胞、晶体蛋白合成量增加、杀虫性能稳定、对环境安全的苏云金芽胞杆菌菌株(BacillusthuringiensisΔleuB)及其应用。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是一种自然界广泛分布的革兰阳性细菌，其主要特征是在菌体形成芽胞的同时，伴随有大量杀虫晶体蛋白(包括Cry和Cyt晶体蛋白)的产生，Bt伴胞晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫具有毒杀作用。因此苏云金芽胞杆菌作为微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业和卫生害虫的防治。然而，与传统的化学农药相比，Bt制剂在田间应用中稳定性差，杀虫持效期相对较短；防治效果易受外界气候和生态条件影响，从而成为制约该杀虫剂发展的瓶颈。因为Bt制剂的活性成分是其所产生的杀虫晶体蛋白，容易受到阳光辐射、温度等天气环境因素的限制，其中紫外线辐射引起的蛋白降解被认为是Bt杀虫剂在田间条件下药效迅速损失最关键的影响因素。另一方面，商品化的Bt制剂一般是杀虫晶体蛋白和芽胞的混合物，芽胞具有很强的抗逆性，这种Bt制剂活芽胞的大面积喷洒和释放会对周边环境的生态带来潜在威胁和破坏。所以，开发杀虫性能稳定、对生态与环境更安全的新一代Bt生物农药十分必要。通过分子遗传改良手段和方法获得无芽胞释放的Bt菌株为实现此目标的重要策略。在Bt中，leuB基因编码的是3-异丙基苹果酸脱氢酶(3-isopropylmalatedehydrogenase,IPMDH,EC:1.1.1.85)，为亮氨酸生物合成途径中的一个关键酶。但是目前对于该基因的研究仅限于基因克隆及其蛋白表达产物的结构特征或酶学活性分析。而在许多真菌细胞中，LeuB不仅调控亮氨酸的生物合成，更是扮演着转录调控因子的角色。在真菌烟曲霉中，LeuB通过与细胞内参与氮代谢和铁离子平衡相关基因的启动子结合，影响烟曲霉在低铁环境下的生长。苏云金芽胞杆菌杀虫谱十分广泛，其作用范围涵盖多种鳞翅目、鞘翅目农业害虫，受到研究者的广泛关注。构建杀虫毒力高、无芽胞释放、安全稳定的Bt工程菌株具广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用，该苏云金芽胞杆菌在LB液体培养基中无成熟芽胞，晶体蛋白合成量增加且母细胞不裂，能延长对靶标昆虫的持效期，杀虫性能稳定，对环境安全。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是，本专利技术之杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌，为苏云金芽胞杆菌ΔleuB(BacillusthuringiensisΔleuB)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCCNO：M2019112。本专利技术之苏云金芽胞杆菌ΔleuB，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示(在Bt4.0718野生型菌株中缺失leuB基因)：本专利技术之苏云金芽胞杆菌ΔleuB，其核苷酸编码的leuB缺失的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示(核苷酸序列最后三位taa是终止子)：本专利技术之杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌在杀虫方面的应用，尤其是适于杀鳞翅目昆虫如小菜蛾、棉铃虫等。本专利技术通过分子遗传改良手段和方法构建Bt工程菌株，从根本上构建出既具高效杀虫活性又无芽胞释放、对环境安全的Bt菌株，继而能工业化生产的Bt工程菌。本专利技术之苏云金芽胞杆菌ΔleuB，在LB液体培养基中能正常形成晶体、但无成熟芽胞，晶体蛋白合成量增加，菌体母细胞裂解完全受阻，晶体蛋白被包裹形成微包囊，既能够帮助晶体蛋白有效抵抗紫外降解，延长对靶标昆虫的持效期，提高杀虫稳定性，突变株对小菜蛾杀虫毒性相比野生菌增强，又能很好的解决芽胞释放带来的环境安全问题，对解决Bt制剂施用过程中的杀虫持效期短和生态安全问题具有一定的应用价值。本专利技术利用I-SceI介导的基因无痕敲除系统对苏云金芽胞杆菌Bt4.0718基因组中的leuB基因成功进行敲除，得到一株苏云金芽胞杆菌突变株，ΔleuB突变株表型变化明显：在LB液体培养基中无成熟芽胞、晶体蛋白合成量增加且母细胞不裂、晶体蛋白被包裹形成微包囊；突变菌对小菜蛾杀虫活性毒力较野生菌有提高，差异较显著。微生物菌株保藏情况说明苏云金芽胞杆菌ΔleuB(BacillusthuringiensisΔleuB)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCCNO：M2019112。附图说明图1为敲除载体pRP8509的构建和鉴定图；图2为ΔleuB突变株的PCR验证图；图3为Bt4.0718与ΔleuB突变株在LB培养基中的生长曲线测定结果图；图4为Bt4.0718与ΔleuB突变株在LB培养基中不同时期菌体形态相差显微镜观察图；图5为Bt4.0718与ΔleuB突变株芽胞和晶体的透射电镜观察图；图6为Bt4.0718与ΔleuB突变株菌体全蛋白SDS-PAGE检测图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。本说明书中，除另有说明外，所述百分比为质量百分比。实施例①本实施例之苏云金芽胞杆菌ΔleuB(BacillusthuringiensisΔleuB)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCCNO：M2019112。②本实施例之苏云金芽胞杆菌ΔleuB构建过程：第一步：构建敲除载体pRP8509：以野生型Bt4.0718菌株基因组为模板，各采用两对引物UlueB-F/UlueB-R和DlueB-F/DlueB-R(引物序列见表1，由上海生工生物技术有限公司合成)进行PCR扩增获得leuB基因的上、下游同源臂，PCR产物的大小分别为690bp和660bp(图1A-B)。将上游同源臂用BamHI/SalI双酶切并回收产物，与经过同样双酶切回收处理的pRP1028载体(由华中农业大学何进教授惠赠)连接并转化，从抗性板上挑取阳性克隆子，提取质粒进行双酶切鉴定，目的片段大小与预期相符(图1-C)，得到的重组质粒命名为pRPUleuB；采用同样的方法将下游同源臂经SalI/KpnI连接至中间质粒pRPUleuB相应的多克隆位点，经SalI/KpnI双酶切重组质粒鉴定出的目的片段大小与预期相符(图1-D)，证明重组载体已成功连上leuB基因的上、下游同源臂，被命名为敲除载体pRP8509。所述野生型Bt4.0718菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo.M200016，参见中国专利ZL01114592.7。表1PCR引物第二步：将敲除载体pRP8509通过三亲本接合转移实验导入野生型Bt4.0718菌株内：首先通过同源单交换，将敲除载体pRP8509整合到基因组中；然后通过I-SceI归巢内切酶介导的第二次同源单交换，即得苏云金芽胞杆菌leuB缺失突变株ΔleuB。经过两次接合转移后挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，共采用两对检测引物。第一对引物为UlueB-F/DlueB-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌，其特征在于，为苏云金芽胞杆菌 Δ

【技术特征摘要】
1.一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌，其特征在于，为苏云金芽胞杆菌ΔleuB，BacillusthuringiensisΔleuB，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCCN...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁学知，全梅芳，彭金莉，谢俊雁，夏立秋，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43