一类生产L-茶氨酸的菌群及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一类生产L‑茶氨酸的菌群及其应用，该菌群为从茶树无菌组织培养苗中分离到的茶树内生菌，属于罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属(Rhodanobacteraceae Luteibacter sp.)。本发明专利技术的生产L‑茶氨酸的菌群，为首次从茶树中分离的内生菌，在LB培养基上生长良好，28℃培养至对数生长期，向培养基中添加谷氨酰胺和乙胺后继续培养7天，实验组较对照组能够检测到L‑茶氨酸的合成，且合成的茶氨酸能够快速分泌到胞外，分泌效率达90％以上，能够高效合成分泌茶氨酸。本发明专利技术的生产L‑茶氨酸方法，以谷氨酰胺和乙胺为底物，操作方法简单，茶氨酸生产效率高，具有良好的工业化应用前景。

A Class of L-Theanine Producing Bacteria and Its Application

The present invention discloses a class of bacterial flora producing L theanine and its application. The bacterial flora is endophytic bacteria isolated from aseptic tissue culture seedlings of tea plants and belongs to Rhodanobacterium teraceae Luteibacter sp. The bacterial flora producing L theanine in the present invention is the endophytic bacteria isolated from tea plant for the first time. It grows well on LB medium, and is cultured to logarithmic growth stage at 28 C. After adding glutamine and ethylamine to the medium, the bacterial flora can continue to grow for 7 days. Compared with the control group, the synthesis of L theanine can be detected in the experimental group, and the synthesized theanine can secrete rapidly to the extracellular space, and the secretion efficiency is up to 90%. On the other hand, theanine can be synthesized and secreted efficiently. The method for producing L theanine of the invention takes glutamine and ethylamine as substrates, has simple operation method, high theanine production efficiency and good industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一类生产L-茶氨酸的菌群及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一类生产L-茶氨酸的菌群及其应用。
技术介绍
茶氨酸(L-Theanine)，是N-乙基-γ-谷氨酰胺，占茶叶中氨基酸总量的70％以上，是茶树中特有的非蛋白质游离氨基酸，也是赋予茶叶特殊风味的主要物质，其含量直接决定茶叶品质。茶氨酸具有放松神经、抗肿瘤、抗抑郁、保护血管、降血压、抑制肥胖及提高机体免疫功能等医药作用，此外，还可以作为功能性食品添加剂应用于食品领域。因此，茶氨酸越来越受到人们青睐，国际市场对其需求量也很大。目前，生产茶氨酸的方法主要有三种。一种是从茶叶中提取。茶叶中茶氨酸含量较低，且原料来源受限，致使生产成本很高。第二种方法是化学合成法。该方法不仅会导致毒性物质残留，且生产的茶氨酸为D-茶氨酸和L-茶氨酸异构体的混合物，拆分精制工艺复杂。第三种方法是利用微生物及其酶发酵生产茶氨酸。目前报道的能合成茶氨酸的微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌，但这些都是自然界游离微生物，不是从茶树体内分离得到的。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一类生产L-茶氨酸的菌群，为首次从茶树中分离的内生菌，满足使用需求。本专利技术的另一目的是提供一种上述菌群在产L-茶氨酸中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一类生产L-茶氨酸的菌群，为从茶树无菌组织培养苗中分离到的茶树内生菌。所述的生产L-茶氨酸的菌群，分离法为：取数片茶树组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2～3天，待叶片周围长出丰富的菌群后，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养，所获得的菌群即为生产L-茶氨酸的菌群。所述的茶树品种为安徽省“舒茶早”、云南省茶树大叶种“云抗10号”、浙江省茶叶品种“龙井43”和“乌牛早”。所述的菌群为罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属。所述的菌群在生产L-茶氨酸中的应用。一种生产L-茶氨酸的方法，步骤如下：1)取数片茶树无菌组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2～3天，待叶片周围长出丰富的菌群后，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养；2)将菌群在28℃振荡培养至OD600为1.0时，向培养液中同时添加终浓度为20mM谷氨酰胺和20mM乙胺，培养1～15d；3)取得的培养液100℃水浴裂解30min，并于-20℃反复冻融2～3次后，12000rpm，离心15min，获得富含L-茶氨酸的上清液。步骤1)中，所述的茶树品种为安徽省“舒茶早”，菌群命名为CsEs。步骤2)中，优选培养7d。步骤1)中，所述的茶树品种为云南省茶树大叶种“云抗10号”、浙江省茶叶品种“龙井43”和“乌牛早”。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的生产L-茶氨酸的菌群，为首次从茶树中分离的内生菌，在LB培养基上生长良好，28℃培养至对数生长期，向培养基中添加谷氨酰胺和乙胺后继续培养7天，实验组较对照组能够检测到L-茶氨酸的合成，而以茶树品种“舒茶早”为例，进行培养1～15d，发现在底物添加后培养1～10d时，茶氨酸含量持续升高，在第10d时茶氨酸含量平均为3.6mg/L，此后持续下降。且合成的茶氨酸能够快速分泌到胞外，分泌效率达90％左右，能够高效合成分泌茶氨酸，具有很好的实用性。附图说明图1是叶片周围长出丰富的菌群图；图2是“舒茶早”茶树内生菌菌群CsEs合成茶氨酸的液相质谱鉴定结果图；图3是“舒茶早”茶树内生菌菌群合成茶氨酸的时间曲线图；图4是“乌牛早”、“云抗10号”及“龙井43”茶树内生菌群合成茶氨酸的质谱鉴定结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例11)四年生安徽省茶树品种“舒茶早”茶树内生菌菌群的分离培养超净工作台无菌操作：取数片茶树无菌组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2～3天，待叶片周围长出丰富的菌群后(如图1)，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养。2)茶树内生菌群合成茶氨酸的样品制备及检测过程将菌群在28℃振荡培养至OD600为1.0时，向LB培养液中同时添加终浓度为20mM谷氨酰胺和20mM乙胺，并分别以不添加任何底物的同浓度菌液和添加同浓度底物的空白培养基作为对照试验，在同样28℃培养条件下，继续培养1d、3d、5d、7d、10d、15d后，分别将不同时间点取得的培养液100℃水浴裂解30min，并于-20℃反复冻融2～3次后，12000rpm，离心15min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤后，利用高效液相色谱和三重四级杆质谱联用仪进行检测鉴定。二级质谱鉴定结果表明：培养液中均稳定含有不同浓度的茶氨酸(质谱结果如图2)，且在底物添加后的第10天时，茶氨酸含量平均约3.6mg/L，最高可达4.5mg/L(如图3)。说明：从离体培养的四年生安徽省茶树品种“舒茶早”茶树组培苗中分离到的菌群具有高效合成茶氨酸的能力。且在底物添加后培养1～10d时，茶氨酸含量持续升高，在第10d时茶氨酸含量平均为3.6mg/L，此后持续下降。实施例21)十年生浙江省茶树品种“龙井43”茶树内生菌菌群的分离培养超净工作台无菌操作：取数片十年生浙江省茶树品种“龙井43”茶树无菌组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2～3天，待叶片周围长出丰富的菌群后，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养。2)茶树内生菌群合成茶氨酸的样品制备及检测过程将菌群在28℃振荡培养至OD600为1.0时，向LB培养液中同时添加终浓度为20mM谷氨酰胺和20mM乙胺，并分别以不添加任何底物的同浓度菌液和添加同浓度底物的空白培养基作为对照试验，在同样28℃培养条件下，继续培养7d后，分别将不同时间点取得的培养液100℃水浴裂解30min，并于-20℃反复冻融2～3次后，12000rpm，离心15min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤后，利用高效液相色谱和三重四级杆质谱联用仪进行检测鉴定。二级质谱鉴定结果表明：底物添加后的第7天，在培养液中能稳定检测到茶氨酸(见图4)。说明：从离体培养的十年生浙江省茶树品种“龙井43”中分离到的菌群在离体培养条件下，具有合成茶氨酸的能力。实施例31)四年生浙江省茶树品种“乌牛早”茶树内生菌菌群的分离培养超净工作台无菌操作：取数片四年生浙江省茶树品种“乌牛早”茶树无菌组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2～3天，待叶片周围长出丰富的菌群后，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养。2)茶树内生菌群合成茶氨酸的样品制备及检测过程将菌群在28℃振荡培养至OD600为1.0时，向LB培养液中同时添加终浓度为20mM谷氨酰胺和20mM乙胺，并分别以不添加任何底物的同浓度菌液和添加同浓度底物的空白培养基作为对照试验，在同样28℃培养条件下，继续培养7d后，分别将不同时间点取得的培养液100℃水浴裂解30mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类生产L‑茶氨酸的菌群，其特征在于，该菌群为从茶树无菌组织培养苗中分离到的茶树内生菌。

【技术特征摘要】
2018.12.17 CN 20181154538161.一类生产L-茶氨酸的菌群，其特征在于，该菌群为从茶树无菌组织培养苗中分离到的茶树内生菌。2.根据权利要求1所述的生产L-茶氨酸的菌群，其特征在于，分离法为：取数片茶树组培苗叶片，用剪刀剪成0.5cm×1.0cm的片状后，随机斜插入固体LB培养基中，封口膜封口，28℃恒温培养箱倒置培养2～3天，待叶片周围长出丰富的菌群后，将其接种到液体LB培养基中进行继续培养，所获得的菌群即为生产L-茶氨酸的菌群。3.根据权利要求2所述的生产L-茶氨酸的菌群，其特征在于，所述的茶树品种为安徽省“舒茶早”、云南省茶树大叶种“云抗10号”、浙江省茶叶品种“龙井43”和“乌牛早”。4.根据权利要求1或2所述的生产L-茶氨酸的菌群，其特征在于，所述的菌群为罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属。5.权利要求1或2所述的菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙俊，常慢慢，宛晓春，张照亮，张正竹，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34