生产L-丝氨酸的重组菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种生产L‑丝氨酸的重组菌，该重组菌与出发菌相比具有提高的甘氨酸裂解系统GCV的表达，出发菌为能够累积L‑丝氨酸的菌株。本发明专利技术还提供了该重组菌的构建方法。本发明专利技术提供的重组菌的生长和葡萄糖消耗能力与野生型菌株相比未见明显减弱，L‑丝氨酸产量显著提高。

Recombinant strain producing L-serine and its construction method

The present invention relates to a recombinant strain producing L serine. Compared with the original strain, the recombinant strain has higher expression of GCV in glycine lysis system, and the starting strain is a strain capable of accumulating L serine. The invention also provides a construction method of the recombinant bacteria. The growth and glucose consumption capacity of the recombinant bacteria provided by the invention has not been significantly reduced compared with the wild type strains, and the production of L serine has been significantly increased.

【技术实现步骤摘要】
生产L-丝氨酸的重组菌及其构建方法
本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及一种生产L-丝氨酸的重组菌及其构建方法。
技术介绍
L-丝氨酸是一种蛋白质氨基酸，它可以为哺乳动物中枢神经系统的生长和发育提供营养，能够维持哺乳动物胚胎正常生长和发育。同时，它还是胞内多种重要生物物质合成所需的一碳单位(one-carbon，C1)的直接供体，在生物体整个代谢网络中占据重要位置。L-丝氨酸还可作为多种有用化合物的合成前体，在化工、制药、化妆品及食品等工业领域具有广泛的用途。目前，L-丝氨酸工业化生产方法主要包括蛋白水解法、固定化酶法、化学合成法和前体发酵法。蛋白质水解提取法存在原料成本高且利用率低、提取工艺复杂和环境污染大等缺点。固定化酶法采用固定化酶或固定化细胞的技术，利用丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)逆向反应催化甘氨酸和甲醛生成L-丝氨酸。由于SHMT催化专一性强、反应条件温和、副产物较少，而成为世界各国酶法生产L-丝氨酸的主要方法。化学合成法生产的产品为DL-丝氨酸，需要进行化学拆分获得L-丝氨酸，生产成本高、工艺复杂。前体发酵法生产L-丝氨酸主要是添加甘氨酸和甲醇作为L-丝氨酸合成的前体，通过SHMT催化的逆向反应合成，或者利用甲基营养型细菌胞内酶系统，催化甘氨酸和C1供体合成L-丝氨酸。前体发酵法存在成本高、底物转化率低的缺点，因此难以满足市场的需求。L-丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，代谢转运速度极快，与其他氨基酸相比，非常不容易积累。因此，工业上仍无法实现利用低廉的糖质原料通过微生物直接发酵法生产L-丝氨酸。现有技术，通常通过直接从环境中筛选、紫外线诱变、底物类似物筛选突变株等传统育种方法分离和筛选能够积累L-丝氨酸的菌株。目前，L-丝氨酸菌株选育的种属(株)主要包括黄色短杆菌(Brevibacteruimflavum)、假单胞菌(Pseudomonasputida)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等。国内主要有新疆农科院微生物研究所和新疆农业大学以黄色短杆菌为出发菌株，通过传统诱变、筛选的方法得到L-丝氨酸产生菌。江南大学通过直接筛选法获得一株能够直接利用糖质原料发酵产L-丝氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062，通过分析培养基中不同碳源、不同氮源、不同维生素等物质的浓度对L-丝氨酸积累的影响，建立了最适的发酵条件，使得L-丝氨酸产量达到6.6g/L。但经过传统诱变育种筛选得到的L-丝氨酸菌株不可避免地积累次级突变，导致菌株生长缓慢，并且菌种的环境耐受力低、产生副产物、性状容易退化等特点都限制了L-丝氨酸的生产效率。现有技术也可通过系统代谢工程改造构建L-丝氨酸工程菌。Peters-Wendisch等通过增加丝氨酸合成途径中的serACB基因的表达，所构建的工程菌能够产L-丝氨酸9g/L(Peters-Wendisch,P.,Stolz,M.,Etterich,H.,Kennerknecht,N.,Sahm,H.,Eggeling,L.AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2005,71:7139-7144.)。Zhang等通过阻断叶酸的代谢途径，抑制丝氨酸羟甲基转移酶的活性，阻断丝氨酸分解为甘氨酸，L-丝氨酸的产酸量仅达到8g/L(Zhang,X.,Xu,G.,Li,H.,Dou,W.,Xu,Z.AppliedBiochemistryBiotechnology,2014,173:1607-1617)。但是该方法严重抑制了菌体生长，且发酵时间长。因此，目前尚缺乏性能优良的采用直接发酵法生产L-丝氨酸的生产菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种性能优良的生产L-丝氨酸的重组菌及其构建方法。为实现上述目的，本专利技术的第一方面提供了一种生产L-丝氨酸的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有提高的甘氨酸裂解系统GCV的表达，所述出发菌为能够累积L-丝氨酸的菌株。根据本专利技术第一方面提供的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有降低的丝氨酸O-乙酰转移酶CysE的表达。优选地，所述重组菌中编码丝氨酸O-乙酰转移酶cysE基因失活和/或cysE基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导。更优选地，所述失活为敲除所述重组菌中的cysE基因，所述低转录或低表达活性的调控元件为Phom启动子。再优选地，Phom启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2自5’末端第928-1057位核苷酸所示。根据本专利技术第一方面提供的重组菌，其中，所述重组菌具有一个或多个编码甘氨酸裂解系统的gcv基因的拷贝。优选地，gcv基因来源选自大肠杆菌Escherichiacoli、恶臭假单胞菌Pseudomonasputida、伯克氏菌Burkholderiamultivorans、枯草杆菌Bacillussubtilis和蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus中的一种或多种。更优选地，所述gcv基因选自编码氨甲基转移酶的gcvT基因、编码载体蛋白的gcvH基因和编码甘氨酸脱氢酶的gcvP基因中的一种或多种。再优选地，所述gcvT基因和gcvH基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述gcvP基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。根据本专利技术第一方面提供的重组菌，所述gcv基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。优选地，所述高转录或高表达活性的调控元件为P45启动子。更优选地，所述P45启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5自5’末端第1005-1182位核苷酸。根据本专利技术第一方面提供的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有降低的丝氨酸羟甲基转移酶GlyA、丝氨酸脱水酶SdaA、丙酮酸羧化酶Pyc和/或顺乌头酸酶Acn的表达。优选地，所述重组菌中GlyA的转录因子glyR基因、编码丝氨酸脱水酶的sdaA基因、编码丙酮酸羧化酶的pyc基因和/或编码顺乌头酸酶的acn基因失活和/或编码GlyA的glyA基因、sdaA基因、cysE基因、pyc基因和/或acn基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导。更优选地，所述失活为敲除所述重组菌中的glyR基因、sdaA基因、pyc基因和/或acn基因，所述低转录或低表达活性的调控元件为Phom启动子。再优选地，Phom启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2自5’末端第928-1057位核苷酸所示。根据本专利技术第一方面提供的重组菌，其中，所述重组菌与出发菌相比具有提高的3-磷酸甘油酸脱氢酶SerAr、磷酸丝氨酸转氨酶SerC、磷酸丝氨酸磷酸酶SerB和/或苏氨酸外排转运蛋白ThrE的表达，其中SerAr为被解除丝氨酸反馈抑制的SerA。优选地，所述重组菌中具有一个或多个编码SerAr的serAr基因、编码SerC的serC基因、编码SerB的serB基因和/或编码ThrE的thrE基因的拷贝，和/或serAr基因、serC基因、serB基因和/或thrE基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。更优选地，所述高转录或高表达活性的调控元件为Peftu启动子和/或Psod启动子。还优选地，所述serAr基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，所述serC基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述serB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产L‑丝氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有提高的甘氨酸裂解系统GCV的表达，所述出发菌为能够累积L‑丝氨酸的菌株。

【技术特征摘要】
1.一种生产L-丝氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有提高的甘氨酸裂解系统GCV的表达，所述出发菌为能够累积L-丝氨酸的菌株。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有降低的丝氨酸O-乙酰转移酶CysE的表达；优选地，所述重组菌中编码丝氨酸O-乙酰转移酶cysE基因失活和/或cysE基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导；更优选地，所述失活为敲除所述重组菌中的cysE基因，所述低转录或低表达活性的调控元件为Phom启动子；再优选地，Phom启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2自5’末端第928-1057位核苷酸所示。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌具有一个或多个编码甘氨酸裂解系统的gcv基因的拷贝，和/或所述gcv基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导；优选地，所述gcv基因来源选自大肠杆菌Escherichiacoli、恶臭假单胞菌Pseudomonasputida、伯克氏菌Burkholderiamultivorans、枯草杆菌Bacillussubtilis和蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus中的一种或多种；更优选地，所述gcv基因选自编码氨甲基转移酶的gcvT基因、编码载体蛋白的gcvH基因和编码甘氨酸脱氢酶的gcvP基因中的一种或多种；再优选地，所述gcvT基因和gcvH基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述gcvP基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；和/或优选地，所述高转录或高表达活性的调控元件为P45启动子；更优选地，所述P45启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5自5’末端第1005-1182位核苷酸。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有降低的丝氨酸羟甲基转移酶GlyA、丝氨酸脱水酶SdaA、丙酮酸羧化酶Pyc和/或顺乌头酸酶Acn的表达；优选地，所述重组菌中GlyA的转录因子glyR基因、编码丝氨酸脱水酶的sdaA基因、编码丙酮酸羧化酶的pyc基因和/或编码顺乌头酸酶的acn基因失活和/或编码GlyA的glyA基因、sdaA基因、pyc基因和/或acn基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导；更优选地，所述失活为敲除所述重组菌中的glyR基因、sdaA基因、pyc基因和/或acn基因，所述低转录或低表达活性的调控元件为Phom启动子；再优选地，Phom启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2自5’末端第928-1057位核苷酸所示。5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌与出发菌相比具有提高的3-磷酸甘油酸脱氢酶SerAr、磷酸丝氨酸转氨酶SerC、磷酸丝氨酸磷酸酶SerB和/或苏氨酸外排转运蛋白ThrE的表达，其中SerAr为被解除丝氨酸反馈抑制的SerA；优选地，所述重组菌中具有一个或多个编码SerAr的serAr基因、编码SerC的serC基因、编码SerB的serB基因和/或编码ThrE的thrE基因的拷贝，和/或serAr基因、serC基因、serB基因和/或thrE基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导；更优选地，所述高转录或高表达活性的调控元件为Peftu启动子和/或Psod启动子；还优选地，所述serAr基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，所述serC基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述serB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，所述thrE基因的核苷酸序列如SEQIDNO.16自5’末端第332-1801位核苷酸所示，所述Peftu启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.23自5’末端第629-828位核苷酸所示，所述Psod启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.26自5’末端第635-826位核苷酸所示。6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌选自棒杆菌属、小杆菌属、短杆菌属中的一株细菌，优选地，所述棒杆菌属的细菌选自谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum、北京棒杆菌Corynebacteriumpekinense、有效棒杆菌Corynebacteriumefficiens、钝齿棒杆菌Corynebacteriumcrenatum、嗜热产氨棒杆菌Corynebacteriumthermoaminogenes、产氨棒杆菌Corynebacteriumaminogenes、百合棒杆菌Corynebacteriumlilium、美棒杆菌Corynebacteriumcallunae和力士棒杆菌Co...

【专利技术属性】
技术研发人员：张芸，温廷益，商秀玲，刘树文，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11