一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，包括：稳定愈伤组织的制备：对罗汉果的种子、叶片或茎段进行诱导，获得稳定愈伤组织；新生愈伤组织的制备：将稳定愈伤组织培养70‑80天，取其褐化的细胞团接种至诱导培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织；可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中进行继代培养，获得可悬浮新生愈伤组织。本发明专利技术在稳定愈伤组织的基础上进行诱导和继代培养，缩短了愈伤组织的生长延滞期和悬浮培养周期，提高了罗汉果幼苗的生长量。

A Method for Preparing Embryogenic Callus of Rapid Growing Siraitia grosvenorii

The invention discloses a method for preparing embryogenic callus of fast-growing Siraitia grosvenorii, which includes: preparation of stable callus: induction of seeds, leaves or stem segments of Siraitia grosvenorii to obtain stable callus; preparation of new callus: culture of stable callus for 70 to 80 days, inoculation of browned cell mass into induction medium for subculture, and acquisition of stable callus. Neonatal callus was obtained; preparation of suspensible embryogenic callus: Neonatal callus with fast growth and yellow-white color was selected for subculture in a new medium to obtain suspensible callus. The invention induces and subcultures the callus on the basis of stabilizing the callus, shortens the growth delay period and suspension culture period of the callus, and improves the growth quantity of Momordica grosvenorii seedlings.

【技术实现步骤摘要】
一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法
本专利技术涉及组织培养
，更具体地说是涉及一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法。
技术介绍
罗汉果是葫芦科多年生藤本植物。罗汉果果实中主要甜味成分是罗汉果甜苷V，它的甜度是蔗糖的300倍，其甜度曲线与蔗糖相似，因为高甜度、低热量、好口感等特点而广为大众喜爱。它是肥胖症、高血压、糖尿病患者等特殊人群最适宜的甜味剂和保健品，具有广泛的应用价值。罗汉果甜苷V主要从天然罗汉果果实中提取获得。但是，天然罗汉果中的固有罗汉果甜苷成分极低，现有技术对于罗汉果的利用率以及罗汉果甜苷的提取率并不高，造成了极大的原料浪费。同时，由于土地资源、气候等自然因素的影响，天然罗汉果的产量受到限制，已不能满足日益增长的市场需求。目前，罗汉果的培育大多采取组织培养的方法，将稳定愈伤组织进行培养，但是稳定级愈伤组织材料生长缓慢，制备悬浮培养的接种细胞工作量大，悬浮培养时细胞生长量少、悬浮周期长、效率低，使得罗汉果的产量依然不能满足市场需求。因此，如何提供一种生长快速、培育周期短的罗汉果胚性愈伤组织是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，在稳定愈伤组织的基础上进行诱导和继代培养，缩短了愈伤组织的生长延滞期，缩短了悬浮培养周期，提高了罗汉果幼苗的生长量。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，包括下述步骤：1)稳定愈伤组织的制备：对罗汉果的种子、叶片或茎段进行诱导，获得稳定愈伤组织；2)新生愈伤组织的制备：将所述步骤1)中所得的稳定愈伤组织培养70-80天，取其褐化的细胞团接种至诱导培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织；3)可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择所述步骤2)中生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中进行继代培养，获得可悬浮新生愈伤组织。以上技术方案达到的技术效果是：本专利技术公开一种获得罗汉果可悬浮培养快速生长的胚性愈伤组织的方法。所得的新生愈伤组织对比初级愈伤组织生长快速，大量的悬浮细胞接种材料易制备，培养周期由21天缩减至15天，且生长延滞期短，生长量也有大幅提升。在少量接种量时也可以生长良好。同样的接种量50g/L(鲜重)时，培养一周期后，初级愈伤细胞的细胞干重为6.73g/L，新生愈伤细胞干重可达15.77g/L。同时经诱导剂作用后罗汉果甜苷V产率与初级愈伤组织相当。可选的，所述步骤1)中诱导的具体过程包括：(1)初级愈伤组织的制备：将所述罗汉果种子、叶片或茎段消毒后，接入pH为5-7的初级诱导培养基中，在温度为20-30℃且无光照的条件下诱导培养15-21天，得到初级愈伤组织；(2)稳定愈伤组织的制备：将所述步骤(1)中获得的初级愈伤组织进行继代培养，获得性状稳定的愈伤组织。可选的，所述步骤2)中诱导培养基包括：含有胆碱0.5-2.0g/L、维生素C0.5-3.0mg/L、蔗糖25-35g/L、琼脂4-5g/L、肌醇80-120mg/L、6-BA0.5-2mg/L及NAA0.5-1.5mg/L的B5固体培养基。以上技术方案达到的技术效果是：胆碱是带正电荷的四价碱基，对植物生长、产量、产品质量、光合性能、膜透性、植物抗性等重要生理作用都有有利影响。对植物供以胆碱，可以提高其耐霜冻能力，并降低膜相变温度。同时，胆碱不仅为膜脂成分提供胆碱基团，而且像植物激素那样对植物具有多样生物学效应，需要在一定的有效浓度范围(0.5-2.0g/L)才能发挥其最佳调控作用；维生素C是一种抗氧化剂，能帮助植物抵抗干旱、臭氧和紫外线带来的压力，同时，维生素C作为一种活性比较高的物质，可以对植物的调节作用起到一定的帮助，在植物于逆境中和衰老的过程中，维生素C可以帮助植物起到保护和延缓的作用。可选的，所述步骤3)中继代培养的条件为：温度为25-30℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d。可选的，所述初级诱导培养基由B5基础盐水溶液培养基、蔗糖25-35g/L、琼脂4-5g/L、肌醇80-120mg/L、6-BA0.5-2mg/L及NAA0.5-1.5mg/L组成可选的，所述B5基础盐水溶液培养基由KNO32500mg/L、MgSO4·7H2O250mg/L、CaCl2·2H2O150mg/L、(NH4)2SO4134mg/L、NaH2PO4.H2O150mg/L、KI0.75mg/L、H3BO33.0mg/L、MnSO4·4H2O10mg/L、ZnSO4·7H2O2.0mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L及盐酸硫铵素10mg/L组成经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种可快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，达到的技术效果是：1)在初级愈伤组织的基础上，继续对其进行诱导，所得的可悬浮胚性愈伤组织对比初级愈伤组织生长快速，大量的悬浮细胞接种材料易制备，培养周期由21天缩减至15天，且生长延滞期短，生长量也有大幅提升。2)在少量接种量时也可以生长良好。同样的接种量50g/L(鲜重)时，培养一周期后，原愈伤细胞的细胞干重为6.73g/L，新生愈伤细胞细胞干重可达15.77g/L。3)在诱导培养基中加入了胆碱和维生素C，提高了植物的抗逆能力。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术实施例3经种子诱导获得的稳定愈伤组织示意图；图2附图为本专利技术实施例3稳定愈伤组织褐化细胞团的示意图；图3附图为本专利技术实施例3新生愈伤组织的示意图；图4附图为本专利技术实施例3可悬浮胚性愈伤组织的示意图；图5附图为本专利技术实施例4可悬浮胚性愈伤组织的示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本实施例用于判断胆碱和维生素C的最佳浓度配比，具体公开了一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，包括下述步骤：1)初级愈伤组织的制备：将所述罗汉果种子消毒后，接入pH为6、由MS基础盐水溶液培养基、蔗糖30g/L、琼脂4.6g/L、肌醇100mg/L、6-BA1.0mg/L及NAA0.5mg/L组成的诱导培养基中，在温度为27℃且无光照的条件下诱导培养15天，即得到初级愈伤组织；2)稳定愈伤组织的制备：将所述步骤1)中获得的初级愈伤组织进行继代培养，获得性状稳定的愈伤组织；3)新生愈伤组织的制备：将所述步骤2)中所得的稳定愈伤组织培养75天，取其褐化的细胞团接种至分别含有a.胆碱0g/L、维生素C0m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：1)稳定愈伤组织的制备：对罗汉果的种子、叶片或茎段进行诱导，获得稳定愈伤组织；2)新生愈伤组织的制备：将所述步骤1)中所得的稳定愈伤组织培养70‑80天，取其褐化的细胞团接种至诱导培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织；3)可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择所述步骤2)中生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中进行继代培养，获得可悬浮新生愈伤组织。

【技术特征摘要】
1.一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：1)稳定愈伤组织的制备：对罗汉果的种子、叶片或茎段进行诱导，获得稳定愈伤组织；2)新生愈伤组织的制备：将所述步骤1)中所得的稳定愈伤组织培养70-80天，取其褐化的细胞团接种至诱导培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织；3)可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择所述步骤2)中生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中进行继代培养，获得可悬浮新生愈伤组织。2.根据权利要求1所述的一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中诱导的具体过程包括：(1)初级愈伤组织的制备：将所述罗汉果种子、叶片或茎段消毒后，接入pH为5-7的初级诱导培养基中，在温度为20-30℃且无光照的条件下诱导培养15-21天，得到初级愈伤组织；(2)稳定愈伤组织的制备：将所述步骤(1)中获得的初级愈伤组织进行继代培养，获得性状稳定的愈伤组织。3.根据权利要求1所述的一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中诱导培养基包括：含有胆碱0.5-2.0g/L、维生素C0.5-3.0mg/L、蔗糖25-35g/L、琼脂4-5g/L、肌醇80-120mg/L、6-BA0.5-2mg/L及NAA0.5-1.5mg/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭美锦，尹学健，王泽建，肖慈英，杭海峰，储炬，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，上海国佳生化工程技术研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31