防止模板转换期间连环化的方法和组合物技术

提供了进行模板转换反应的组合物和方法，其可包括减少或消除模板转换寡核苷酸(TSO)的连环化。在一些实施方式中，组合物可包含位点特异性核酸切割酶、包括位点特异性核酸切割酶的识别序列的TSO——其中TSO在其3’端具有与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸互补的至少一个核苷酸——和在识别序列处切割TSO的位点特异性核酸切割酶。

Method and composition for preventing linkage during template conversion

Compositions and methods for template conversion reactions are provided, which may include reducing or eliminating the cyclization of template conversion oligonucleotides (TSO). In some embodiments, the composition may comprise site-specific nucleic acid cleavage enzymes, TSOs comprising recognition sequences of site-specific nucleic acid cleavage enzymes, in which TSO has at least one nucleotide complementary to one or more non-template nucleotides added to the template DNA chain by reverse transcriptase at its 3'end, and site-specific nucleic acid cleavage enzymes that cleave TSO at the recognition sequence.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】防止模板转换期间连环化的方法和组合物交叉参考本申请要求2016年8月18日提交的美国非临时申请序号15/240,166、2016年7月29日提交的美国临时申请序号62/368,656、2016年8月3日提交的美国临时申请序号62/370,469、2016年8月3日提交的美国临时申请序号62/370,501和2016年8月18日提交的美国临时申请序号62/376,493的权益，所有申请通过引用并入本文。
技术介绍
在多种RNA测序(RNA-Seq)方法中，模板RNA被扩增。一种扩增方法利用逆转录酶的模板转换活性。在这种方法中，逆转录酶将一个或多个非模板核苷酸添加到模板cDNA的3’端上，并然后将模板转换成具有与已添加到cDNA的3’端的非模板核苷酸互补的5’序列的寡核苷酸。模板转换被描述在例如US5,962,272、Zhuetal.(Biotechniques200130:892–897)和图1中。模板转换方法导致cDNA在其3’端具有模板转换寡核苷酸的互补序列(complement)。cDNA可利用与模板转换寡核苷酸的互补序列杂交的引物以及另一引物(例如，随机引物、寡dT引物或基因特异性引物)而被扩增。利用模板转换的方法的一个问题是，聚合酶可在3’端处在模板合成与非模板合成之间反复转换。具体地，逆转录酶可将一个或多个非模板核苷酸添加到转换寡核苷酸的互补序列上，这导致逆转录酶将模板从一种转换寡核苷酸转换成另一种转换寡核苷酸。这导致转换寡核苷酸的互补序列的多个拷贝被添加到cDNA的3’端上。这种cDNA——其在3’端含有模板转换寡核苷酸的互补序列的连环体(concatemer)——可导致非特异性背景(non-specificbackground)和浪费的并且因此高成本的测序能力。本公开提供了此问题的解决方案。
技术实现思路
除了其它方面，本文提供了组合物，其包含逆转录酶、包含位点特异性核酸切割酶的识别序列的模板转换寡核苷酸——其中模板转换寡核苷酸在其3’端具有能与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸杂交(即，互补)的至少一个核苷酸——和位点特异性核酸切割酶。还提供了制备cDNA的方法。此方法可包括：获得包括上述组合物和RNA模板的反应混合物；和培育该反应混合物以产生在3’端包含添加序列的cDNA分子，该添加序列包含模板转换寡核苷酸的序列的互补序列。在此方法中，在(b)的培育期间，位点特异性核酸切割酶防止cDNA分子的3’端的模板转换寡核苷酸的双链形式的连环体。还提供了试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括逆转录酶；模板转换寡核苷酸，其包含位点特异性核酸切割酶的识别序列，其中模板转换寡核苷酸在其3’端具有与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸互补的一个或多个核苷酸；和位点特异性核酸切割酶，其识别模板转换寡核苷酸中的识别序列。在本方法中，逆转录酶将模板从RNA转换成模板转换寡核苷酸，以产生含有模板转换寡核苷酸的互补序列的cDNA。在模板转换寡核苷酸被复制到cDNA的3’端上后，模板转换寡核苷酸和/或模板转换寡核苷酸的互补序列然后被位点特异性核酸切割酶切割。这种切割防止模板转换寡核苷酸的互补序列的连环体形成。本公开的实施例部分(其结果显示在图4-6中)显示，这种方法在减少否则通过模板转换形成的各种长度的连环体所引起的背景非常有效。在一些情况下，整个模板转换反应可任选地在含有模板核酸或细胞裂解物的单个反应容器中进行。这避免了任何不必要的材料损失。反应器中的一种或多种反应剂或模板核酸可在液体形式中游离(如在溶液中游离)，或可被固定在固体载体上。例如，任选地，模板核酸、酶、接头寡dT和/或TSO中的任何一种或多种可被固定。在一方面，本文描述的方法包括固定cDNA产物的步骤。因此在一方面，RNA逆转录的cDNA产物被固定。逆转录酶/模板转换的cDNA产物的固定是一种在RNA-Seq程序以两个连续步骤进行的情况下防止反应步骤(即，逆转录和模板转换；和扩增(如用于测序扩增子的PCR))之间遗留(carryover)的方法。全部或部分cDNA扩增子可按需被扩增。模板转换寡核苷酸可包括标记，如标签(tag)或报道分子，用于跟踪连环体切割的完成。这种标记可包括被本领域普通技术人员用于跟踪DNA依赖性反应(报道分子)或固定或扩增DNA依赖性反应(标签)的任何分子。报道分子的一个实例是猝灭标记，使得基于切割而发生荧光信号，该荧光信号否则会因两个寡核苷酸非常接近而猝灭。标签的一个实例是适配体或生物素分子或可被用于与底物反应以固定cDNA的功能相似的分子。任选地，标记可通过如上所述用于固定反应的反应剂或产物中的任何一种或多种的试剂进行。附图说明当结合附图阅读时，可由以下详细描述最充分地理解本专利技术的一些实施方式。要强调的是，根据惯例，附图的各种特征不是按比例的。实际上，为清楚起见，各种特征的尺寸被任意地扩大或缩小。附图中包括下列图。图1显示利用模板转换制备的cDNA文库的示意性示例。(1)mRNA显示具有聚A尾。具有已知序列(接头-寡dT)的寡核苷酸cDNA合成引物(总体上，DNA)通过聚A尾与mRNA杂交，并引导(primes)逆转录酶。逆转录酶使第一链cDNA沿着mRNA合成到mRNA的5’端。在此实例中，逆转录酶将非模板dCdCdC添加到cDNA产物其3’端。(2)合成TSO通过3’-端核苷酸序列(在此通过rGrGrG示例)设计，其可退火(anneal)至在cDNA的3’端处通过非模板添加而添加的序列。逆转录酶然后从复制mRNA转换到复制TSO。(3)与第一链cDNA3’端中添加序列的部分或全部以及cDNA5’端序列(即cDNA合成引物的互补序列)的部分或全部杂交的PCR引物然后被添加到反应，以扩增cDNA。图2显示在通过逆转录酶进行模板转换期间发生的连环体形成的示意性示例。在逆转录酶复制到TSO的末端后，其添加非模板核苷酸(在此实例中是一串dC)，该非模板核苷酸可与逆转录酶可用来作为底物的另一TSO杂交。以这种方式，TSO序列的连环体生成。在PCR期间，PCR引物退火至连环体中的各TSO，以产生各种长度的扩增子，其中一些包括连环体的扩增子，而不是cDNA。图3显示用位点特异性核酸切割酶(在此通过限制酶BsrDI示例)切割TSO的示意性表示。切割位点被设计并被引入TSO其5’端，并且切割酶在扩增之前的逆转录步骤期间被添加到反应混合物。切割酶通过在TSO5’端的位置处切割DNA来去除或防止连环体。在此实例中，反应条件包括将逆转录酶和切割酶(BsrDI)两者在42℃下培育90分钟。相同的条件对两种酶都有效。因此，导致逆转录和连环体形成的抑制。此外，两种酶还通过相同的温度条件被灭活。在此实例中，发现70℃、10分钟的条件是有效的。图4显示来自利用模板转换制备的mRNA文库的(Agilent，SantaClara，CA)痕迹的虚拟凝胶，其中TSO含有位点特异性核酸切割酶的识别序列。在此情况下，位点特异性核酸切割酶是在此通过BsrDI示例的限制性核酸内切酶。泳道1显示在不存在限制性核酸内切酶的情况下，具有由连环体引起的背景污染的结果，和泳道2显示限制性核酸内切酶切割去除背景的效果。图5显示核酸浓度不是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物，其包含：(a)逆转录酶；(b)模板转换寡核苷酸，包含位点特异性核酸切割酶的识别序列，其中所述模板转换寡核苷酸在其3’端具有能与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸杂交的至少一个核苷酸；和(c)所述位点特异性核酸切割酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.29 US 62/368,656;2016.08.03 US 62/370,469;1.组合物，其包含：(a)逆转录酶；(b)模板转换寡核苷酸，包含位点特异性核酸切割酶的识别序列，其中所述模板转换寡核苷酸在其3’端具有能与通过逆转录酶添加到模板cDNA链的一个或多个非模板核苷酸杂交的至少一个核苷酸；和(c)所述位点特异性核酸切割酶。2.权利要求1所述的组合物，其进一步包含RNA模板。3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述RNA模板是总RNA或聚A+RNA。4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述RNA模板是来自哺乳动物的RNA。5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述RNA模板包含5’修饰GMP帽。6.权利要求5所述的组合物，其中所述5’修饰GMP帽是7-甲基鸟苷或亲和标签标记的GMP帽。7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其进一步包含cDNA合成引物，其中所述cDNA合成引物是寡(dT)引物、随机引物、或转录物特异性引物。8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其进一步包含具有不与所述RNA模板杂交的5’尾的cDNA合成引物。9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述模板转换寡核苷酸是DNA-RNA嵌合体。10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述模板转换寡核苷酸在所述位点特异性核酸切割酶的所述识别序列与其3'端处与所述模板cDNA链的3’端处的所述非模板核苷酸互补的所述至少一个核苷酸之间包含扩增引物序列、和任选地分子条形码序列。11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述模板转换寡核苷酸在其3'端处包含3个核糖鸟嘌呤残基。12.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶选自莫洛尼氏鼠白血病毒(M-MLV)、缺乏RNA酶H活性的M-MLV逆转录酶、人T细胞白血病毒I型(HTLV-I)逆转录酶、牛白血病病毒(BLV)逆转录酶、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶；和其变体。13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶是热稳定的。14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶切割双链DNA。15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶是热稳定的。16.权利要求1至14中所述的组合物，其中所述位点特异性核酸切割酶在20℃至65℃范围内的温度下是活性的。17.权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·管，T·C·小埃文斯，N·尼克尔斯，Y·贝，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US