离体BITE激活的T细胞制造技术

通过优化靶细胞和免疫效应细胞之间的接近度，在靶细胞杀伤活性方面可以增强高效免疫效应细胞的产生和鉴定。本文所述的癌症杀伤T细胞可以为多种癌症类型例如实体癌症，血液癌症及其转移形式提供高效治疗。本文提供了产生癌症杀伤T细胞的离体方法，包含此种免疫细胞的组合物；使用所述细胞的方法，选择用于增强靶细胞杀伤活性的最佳试剂的方法，选择优化的免疫细胞的方法和使用该方法评估患者对其他癌症治疗的应答性的方法。

In vitro BITE-activated T cells

By optimizing the proximity between target cells and immune effector cells, the production and identification of highly effective immune effector cells can be enhanced in terms of killing activity of target cells. The cancer killer T cells described in this paper can provide effective treatment for various types of cancer such as solid cancer, blood cancer and its metastasis. This article provides an in vitro method for producing cancer killer T cells, including the composition of such immune cells; using the cell method, selecting the best reagent for enhancing the killing activity of target cells, selecting the optimal immune cell method and using this method to evaluate the patient's response to other cancer treatments.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】离体BITE激活的T细胞专利技术背景过继细胞疗法(ACT)是涉及从患者收集免疫细胞，扩增细胞以及将细胞重新引入同一患者或不同患者的过程。例如，供体来源的离体扩增的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的ACT已经成为治疗癌症的有希望的方法。ACT的实例包括培养的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，分离和扩增的T细胞克隆，以及表达常规T细胞受体或嵌合抗原受体的基因工程化淋巴细胞(例如T细胞)。基因工程化淋巴细胞被设计用于消除表达特定抗原的癌细胞并扩增并递送给患者。ACT的另一个例子是在施用癌症疫苗后从患者的血液中分离和使用T细胞。ACT可以提供肿瘤特异性淋巴细胞(例如，T细胞)，其导致患者中肿瘤细胞的减少。然而，ACT的限制可包括例如T细胞的脱靶激活和/或关于选择最不可能靶向非癌组织的抗原的担心。仍然需要一种选择适当的T细胞亚群(例如，CTL)以提供有效治疗同时使不良副作用最小化的方法。专利技术概述本公开至少部分地特征在于产生激活的免疫效应细胞(例如，激活的T细胞)的优化方法，所述免疫效应细胞选择性地和有效地靶向患病组织(例如，癌症)。在一个实施方案中，激活的免疫细胞(例如，激活的T细胞)诱导靶细胞(例如癌细胞)的杀伤。激活的T细胞在本文中通常称为“癌症杀伤T细胞”，该术语包括激活的肿瘤抗原特异性T细胞，包括但不限于效应记忆T细胞，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，辅助T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和胞啃T细胞(trogocytoticTcell)。本公开至少部分地基于以下出人意料的发现：通过例如优化靶标(例如，癌症)细胞和免疫效应细胞之间的接近度(proximity)，可以增强在靶细胞杀伤活性方面高度有效的免疫效应细胞(例如，T细胞)的产生和鉴定。本文所述的癌症杀伤T细胞可以为多种癌症类型(例如实体癌症，血液癌症及其转移形式)提供高效治疗。使用本文公开的癌症杀伤T细胞的疗法也适用于治疗通常不在受试者中引起强烈免疫应答的癌症，例如除黑素瘤之外的癌症。在实施方案中，本文公开的癌症疗法可以例如通过产生选择性且有效地靶向受试者癌症的癌症杀伤T细胞(例如，自体癌症杀伤T细胞)针对给定受试者定制或个性化。因此，本文提供了产生具有增强的靶细胞杀伤活性的免疫效应细胞(例如，癌症杀伤T细胞)的方法；包含此类免疫细胞的组合物；使用所述细胞的方法(例如，治疗方法)；选择用于增强靶细胞杀伤活性(例如，通过增强靶细胞和免疫细胞(例如T细胞)之间的接近度，例如空间接近度)的最佳试剂的方法；选择优化的(例如，最高活性级分/克隆)免疫细胞例如T细胞的方法；以及使用该方法评估患者对其他癌症治疗的应答性的方法。产生癌症杀伤T细胞的方法在一个方面，本文提供了产生(例如，制备/提供)癌症杀伤T细胞的方法。所述方法包括：(a)提供来自患有癌症(例如，血液癌症，实体癌症，转移性癌症或其组合)的受试者的T细胞；(b)提供例如来自所述受试者的癌细胞；(c)例如在足以激活T细胞(例如，通过使T细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，形成离体反应混合物，所述离体反应混合物包含T细胞，癌细胞和邻近免疫辅导因子(proximityimmuno-coachingfactor，pICF)。在一些实施方案中，激活的T细胞从癌细胞获得细胞表面标志物，例如，变成胞啃T细胞。在一些实施方案中，癌细胞和T细胞存在于样品中，例如来自患有癌症的受试者的样品。在一个实施方案中，癌细胞和T细胞存在于相同的样品中，例如单个样品(例如，如本文所述的样品)。在其他实施方案中，癌细胞和T细胞存在于不同的样品中，例如，来自例如患有癌症的受试者的一个或多个样品(例如，如本文所述的一个或多个样品)。在实施方案中，该方法(例如，产生方法)的步骤(a)和步骤(b)包括提供包含癌细胞和T细胞两者的一个样品。在实施方案中，该方法(例如，产生方法)的步骤(a)和步骤(b)包括提供两个样品，其中所述两个样品中的一个包含癌细胞，并且另一个样品包含T细胞。在实施例中，该方法还包括以下之一，两个，三个或全部：i)扩增来自(c)的癌症杀伤T细胞；ii)选择来自(c)的癌症杀伤T细胞；iii)富集来自(c)的癌症杀伤T细胞；或iv)纯化来自(c)的癌症杀伤T细胞。另一方面，本文还提供了产生(例如，制备/提供)癌症杀伤T细胞的方法。所述方法包括：(a)提供包含癌细胞和T细胞(例如来自患有癌症(例如，血液癌症，实体癌症，转移性癌症或其组合)的受试者)的样品(“癌细胞和T细胞样品”)；(b)例如在足以激活T细胞(例如，通过使T细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，使所述样品与邻近免疫辅导因子(pICF)接触(在实施方案中，形成产生癌症杀伤T细胞的离体反应混合物)；(c)富集所述癌症杀伤T细胞，例如激活的T细胞(例如，已经从癌细胞获得细胞表面标志物的T细胞)。在另一方面，本文的特征在于产生(例如，制备/提供)癌症杀伤T细胞的方法。所述方法包括：(a)提供癌症样品，例如包含癌细胞(例如来自血液癌症，实体癌症，转移性癌症的癌细胞(例如，循环肿瘤细胞(CTC)或其组合)的样品，所述样品例如来自患有癌症的受试者；(b)提供T细胞样品，例如包含T细胞的样品(例如，血液样品(例如，外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，脾样品，包含细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的肿瘤样品或其组合)，所述样品例如来自患有癌症的受试者；(c)例如在足以激活T细胞(例如，使T细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，使来自步骤(a)的样品与来自步骤(b)的样品和邻近免疫辅导因子(pICF)接触(在实施方案中，形成产生癌症杀伤T细胞的离体反应混合物)；和(d)富集所述癌症杀伤T细胞，例如激活的T细胞(例如，已经从癌细胞获得细胞表面标志物的T细胞)。在本文公开的任何方法和组合物的一些实施方案中，样品是选自血液癌症，实体癌症，转移性癌症(例如，CTC，原发性，继发性或其他转移性癌症)或其组合的癌症样品。在本文公开的任何方法和组合物的另一个实施方案中，样品是选自血液样品(例如外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，脾样品，包含CTL，TIL的肿瘤样品或其组合的T细胞样品。在本文公开的任何方法和组合物的实施方案中，基本上没有组分(例如细胞)从样品中除去或分离。在本文公开的任何方法和组合物的实施方案中，样品基本上保持来自原始组织的微环境，例如，基本上维持肿瘤或免疫微环境的结构。在本文公开的任何方法和组合物的实施方案中，样品包含肿瘤抗原特异性T细胞(例如，CTL或TIL)。不受理论束缚，肿瘤抗原特异性T细胞可以是免疫抑制的，例如，当存在于肿瘤微环境中时是免疫抑制的。在一个实施方案中，免疫抑制的肿瘤抗原特异性T细胞在本文所述的条件下激活，例如在与癌细胞和pICF接触后激活。在本文公开的任何方法和组合物的一些实施方案中，样品包含癌细胞和T细胞。例如，样品可以来自包括T细胞(例如，肿瘤抗原特异性CTL)的血液癌症(例如，骨髓，淋巴结源性癌症)。血液样品也可包含癌细胞，例如白血病或淋巴瘤母细胞(例如，表达一种或多种选自CD19，CD123，CD20或其他标志物的母细胞)。在实施方案中，向样品中添加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产生癌症杀伤T细胞或癌症杀伤T细胞制剂的体外方法，其包括：(a)提供包含来自患有癌症的受试者的至少一个T细胞的样品；(b)提供包含至少一个癌细胞的样品；(c)在足以允许所述至少一个T细胞从所述至少一个癌细胞获得细胞表面标志物的条件和时间下，形成包含所述至少一个T细胞，所述至少一个癌细胞和邻近免疫辅导因子(pICF)的离体反应混合物，由此产生至少一个癌症杀伤T细胞；以及(d)以下体外步骤中的一个，二个，三个或全部：i)扩增来自(c)的癌症杀伤T细胞；ii)选择来自(c)的癌症杀伤T细胞；iii)富集来自(c)的癌症杀伤T细胞；或iv)纯化来自(c)的癌症杀伤T细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.13 US 62/321,9641.产生癌症杀伤T细胞或癌症杀伤T细胞制剂的体外方法，其包括：(a)提供包含来自患有癌症的受试者的至少一个T细胞的样品；(b)提供包含至少一个癌细胞的样品；(c)在足以允许所述至少一个T细胞从所述至少一个癌细胞获得细胞表面标志物的条件和时间下，形成包含所述至少一个T细胞，所述至少一个癌细胞和邻近免疫辅导因子(pICF)的离体反应混合物，由此产生至少一个癌症杀伤T细胞；以及(d)以下体外步骤中的一个，二个，三个或全部：i)扩增来自(c)的癌症杀伤T细胞；ii)选择来自(c)的癌症杀伤T细胞；iii)富集来自(c)的癌症杀伤T细胞；或iv)纯化来自(c)的癌症杀伤T细胞。2.权利要求1的方法，其中pICF在所述制剂中以按重量计0.005％-10％的浓度存在。3.权利要求1或2中任一项的方法，其中pICF具有提供对所述T细胞的亲和力的第一元件和对所述癌细胞具有亲和力的第二元件，其中所述第一元件结合T细胞并且不结合实质数量的癌细胞，并且其中所述第二元件结合癌细胞并且不结合实质数量的T细胞。4.权利要求3的方法，其中所述结合T细胞的第一元件包括下列细胞受体中的一种或多种：CD8，CD3，CD4，α/βT细胞受体(TCR)，CD45RO和/或CD45RA。5.权利要求3的方法，其中所述第二元件结合以下中的一种或多种：CD20，CD30，CD33，CD52，EpCAM，CEA，gpA33，黏蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，PSMA，叶酸结合蛋白，选自GD2，GD3，或GM2的神经节苷脂，Lewis-Y2，VEGF，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，ErbB2/HER2，ERbB3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANKL，FAP，生腱蛋白，CD123，CD19，或BCMA。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中pICF包含选自以下的双特异性抗体分子：双特异性免疫球蛋白(BsIgG)，与另外的抗原结合分子可操作地连接的免疫球蛋白，包含通过选自双亲和性重靶向(DART)抗体片段或双特异性T细胞衔接子(BiTE)的接头可操作地连接的两个或更多个scFv片段的双特异性抗体(BsAb)片段，双特异性融合蛋白或BsAb缀合物。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中pICF是选自由以下组成的列表的双特异性抗体：BsMAbCD123/CD3，BsMAbCD19/CD3和EpCAM/CD3。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述癌症杀伤T细胞的扩增包括将癌症杀伤T细胞的数量增加2倍至106倍或更多。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述癌症杀伤T细胞的选择或其制备基于选自以下中的一个或多个的参数：增加的癌细胞杀伤活性，降低的毒性，降低的脱靶效应，增加的生存力，增加的增殖，或有效E∶T比率。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述选择和/或富集步骤(d)包括：使用经荧光标记的化合物，所述经荧光标记的化合物结合i)一种或多种癌症抗原，或扩散到癌细胞膜中或ii)激活的T细胞的一种或多种标志物，或i)和ii)两者；或者使用涂覆有抗体或其片段的珠，所述抗体或其片段结合i)一种或多种癌症抗原或ii)激活的T细胞的一种或多种标志物，或i)和ii)两者。11.权利要求10的方法，其中所述癌症杀伤T细胞制剂包含胞啃癌症杀伤T细胞，其浓度为所述制剂中细胞总数的至少50％。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述癌症杀伤T细胞或制剂包含一个或多个CD8+T细胞和/或一个或多个CD25+T细胞，和/或一个或多个CD8+/CD25+T细胞和/或一个或多个CD4+/CD25+T细胞，和/或一个或多个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或一个或多个肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和/或一个或多个胞啃T细胞。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述癌症杀伤T细胞制剂包含浓度小于所述制剂中细胞总数的10％的调节性T细胞(Treg)；和/或浓度小于所述制剂中细胞总数的10％的初始T细胞。14.权利要求1-13中任一项的方法，其还包括从所述癌症杀伤T细胞制剂中分离个体克隆，其中所述分离步骤包括通过以下方式的单细胞的克隆扩增：(i)将所述癌症杀伤T细胞制剂分离成单细胞和(ii)扩增所述单细胞以产生一个或多个癌症杀伤T细胞制剂。15.权利要求1-14中任一项的方法，其中步骤(a)的样品和步骤(b)的样品来自相同的受试者。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中步骤(a)和步骤(b)包括提供包含癌细胞和T细胞两者的一个样品。17.权利要求1-16中任一项的方法，其中样品(a)来源于具有微环境的组织，其中基本上没有组分从所述样品中除去或分离，所述组织选自：全血，外周血，骨髓，淋巴结，原发肿瘤的活组织检查，或转移的活组织检查或脾。18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述受试者是成人或儿科受试者。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中样品(b)的癌症是选自以下的血液癌症：霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，淋巴浆细胞淋巴瘤，毛细胞白血病)，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，骨髓增生异常综合征，多发性骨髓瘤或急性淋巴细胞白血病。20.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述癌症是选自以下的实体癌症：卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域的癌症，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，卡波西肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊柱轴肿瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，所述癌症的转移病灶，或其组合。21.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述癌症不是黑素瘤。22.权利要求1-21中任一项的方法，其中提供样品(a)和/或样品(b)的受试者：(a)未接受过在先的癌症治疗；(b)已接受过一次或多次在先的癌症治疗；或(c)具有最小残留疾病(MRD)。23.权利要求1-22中任一项的方法，其还包括使用与先前步骤(a)-(d)中使用的样品不同的T细胞和癌细胞样品重复步骤(a)-(d)。24.权利要求23的方法，其中将由步骤(a)-(d)的每次重复产生的癌症杀伤T细胞汇集以形成癌症杀伤T细胞的混合物。25.权利要求1-24中任一项的方法，其还包括评估所述癌症杀伤T细胞或癌症杀伤T细胞制剂的癌症杀伤活性。26.权利要求25的方法，其中评估包括：(a)提供根据权利要求1-25的方法能获得的癌症杀伤T细胞或其制剂；(b)提供癌细胞，其中所述癌细胞来自相同的受试者；(c)使所述癌症杀伤T细胞或其制剂与所述癌细胞接触足以使所述癌症杀伤T细胞杀伤所述癌细胞的一段时间；(d)确定步骤(c)后的癌细胞水平，并任选地确定步骤(c)后的癌症杀伤T细胞水平；并且任选地，(e)确定来自步骤(d)的癌细胞比T细胞或T细胞比癌细胞的比率。27.权利要求26的方法，其中步骤(c)还包括以增加的剂量添加pICF。28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所述癌症杀伤T细胞的活性由癌症杀伤T细胞和癌细胞的剂量应答和/或药效学参数确定，所述参数选自EC50，Emax，有效E∶T比率或动力学参数。29.权利要求25-28中任一项的方法，其中癌细胞的水平或量相对于参考水平的降低表明癌细胞杀伤增加，或者其中癌细胞的水平或量相对于参考水平的变化减小或基本上没有变化表明癌细胞杀伤减少。30.权利要求25-29中任一项的方法，其中高的有效E∶T比率表明所述癌症杀伤T细胞或其制剂是癌细胞的有效杀伤剂，并且其中定义为癌细胞与T细胞的低比率的癌细胞相对于T细胞的低水平表明T细胞杀伤活性差。31.权利要求30的方法，其中1比10或更高的有效E∶T比率表明有效的T细胞杀伤活性，并且1比1，3或5的比率表明T细胞杀伤活性差。32.权利要求27-31中任一项的方法，其中癌细胞和/或癌症杀伤细胞的水平在步骤(c)后0至72小时或若干天的时间测定。33.权利要求1-32中任一项的方法，其中使用基于自动荧光的平台进行所述方法。34.组合物，其包含通过权利要求1-33中任一项的方法能获得的胞啃癌症杀伤T细胞或其制剂。35.权利要求34的组合物，其中所述胞啃癌症杀伤细胞：(i)对癌细胞具有细胞毒性活性，并且(ii)包含至少100个拷贝的癌细胞表面标志物；并包含可检...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡安·安东尼奥·巴莱斯特罗斯诺贝乐，特里沙·安·本奈特，皮勒·赫尔南德斯坎波，克里斯蒂娜·戈麦兹冈萨雷兹，胡里安·高罗沙蒂格吉伦，杰奎因·马丁内兹洛佩兹，艾里西亚·罗伯里斯马蒂奥斯，丹尼尔·普里默拉莫斯，
申请(专利权)人：维维雅生物技术公司，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES