充分多样的双亲性MHC II结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及充分多样的双亲性MHC II结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用。双亲性MHC II结合多肽序列结构为脂肪酰‑β折叠肽‑C‑MHCⅡ结合多肽‑亲水型β折叠肽‑马来酰亚胺，双亲性MHC II结合多肽通过自组装形成免疫载体微球，偶联基团位于微球表面。特别适于制备用于良性疾病治疗的抗体疫苗和制备用于肿瘤治疗的抗体疫苗。抗原可偶联在免疫载体微球表面的偶联基团上。抗体疫苗还可以与FcR‑CART细胞或NK细胞联用。

Full diversity of amphiphilic MHC II binding polypeptide and immunocarrier microspheres and their preparation methods and Applications

The invention relates to amphiphilic MHC II binding polypeptide, immune carrier microspheres, preparation method and application thereof. The sequence structure of amphiphilic MHC II binding polypeptide is aliphatic acyl beta-folding peptide C MHC II binding polypeptide hydrophilic beta-folding peptide maleimide. Amphiphilic MHC II binding polypeptide forms immune carrier microspheres by self-assembly, and the coupling groups are located on the surface of microspheres. It is especially suitable for the preparation of antibody vaccines for benign diseases and for the preparation of antibody vaccines for cancer treatment. The antigen can be coupled to the conjugated groups on the surface of the immune carrier microspheres. Antibody vaccines can also be combined with FcR CART cells or NK cells.

【技术实现步骤摘要】
充分多样的双亲性MHCII结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用[
]本专利技术涉及免疫载体微球领域，具体涉及充分多样的双亲性MHCII结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用。[
技术介绍
]一、治疗性疫苗接种疫苗是人类抵御和控制传染性疾病的有效手段之一。传统意义上的疫苗主要是预防性疫苗，其应用对象是健康群体的易感动物及人群，其疫苗成分一般为微生物保护性抗原，可在健康肌体中激活特异性免疫应答，产生特异性抗体和细胞毒T淋巴细胞(CTL)，从而获得对该病原体的免疫预防能力。治疗性疫苗(TherapeuticVaccine)是近年建立和发展起来的免疫治疗新概念，是指能够打破慢性感染者体内免疫耐受，重建或增强免疫应答的疫苗。治疗性疫苗能在已患病个体诱导特异性免疫应答，消除病原体或异常细胞，使疾病得以治疗，是抗病毒、抗肿瘤的新治疗手段。根据作用机制不同治疗性疫苗可分为两类，一类是通过产生效应细胞起作用，如产生特异性杀伤性T细胞，用于肿瘤治疗或是清除病毒(HBV、HCV、HIV、HPV等)感染细胞；另一类是通过诱导体内产生抗体起作用，抗体可以结合活性分子进而封闭活性分子的功能，抗体还可以通过补体及ADCC效应杀伤肿瘤细胞。本专利技术是以产生抗体为主的治疗性疫苗。二、抗体用于疾病治疗抗体治疗疾病是单克隆抗体技术特别是人源化单克隆抗体技术发展的成果，目前上市临床应用的单克隆抗体超过30种，临床试验中的超过00种，在研的治疗用单克隆抗体超过500种，2013年单克隆抗体销售额超过500亿美元。单克隆抗体研发周期长、生产成本高、治疗费用昂贵。治疗性抗体型疫苗的研究目标是，通过抗原免疫产生内源性抗体来取代外源性单克隆抗体以实现治疗作用。三、抗体产生的免疫学过程B细胞分泌抗体有二种主要机理：T细胞依赖途径(Td)和T细胞非依赖途径(Ti)。大多数蛋白质产生抗体是Td型途径。B细胞Td型表达抗体需要双信号活化：抗原表位(B表位)与B细胞受体结合，这是第一信号。抗原通过与B细胞受体结合途径进入B细胞，在细胞的溶酶体(Lysosome)、核内体(Endosome)内水解成多肽片断并与MHCⅡ结合后，转到细胞膜上展示于B细胞表面，提呈MHCⅡ结合多肽表位(也称Th表位或T表位))给CD4+Th细胞受体。Th细胞识别载体蛋白表位，活化Th细胞释放细胞因子，作为B细胞活化分泌抗体的第二信号激活B细胞进入增殖程序，亲和力成熟过程(体细胞突变机利)获得分泌高亲和力、高滴度水平抗体的能力。休止状态的Th细胞还不能满足B细胞活化要求，需要DC细胞吞噬抗原，将Th表位通过MHCⅡ提呈给Th细胞激活Th细胞。由此说明，B细胞分泌抗体，实际上涉及上述三个基本过程。DC细胞倾向吞噬颗粒抗原，因此可溶性蛋白一般难以产生高滴度抗体。传统方法是将可溶性蛋白制成乳剂颗粒或吸附于称之谓免疫佐剂凝肽颗粒，才能获得更高滴度抗体。颗粒抗原可以无须免疫佐剂获得高滴度抗体。颗粒化抗原易产生高滴度抗体是免疫实验中普遍现象。一般外源性蛋白均含有B及Th表位，在佐剂条件下免疫动物和人可以产生抗体。内源性蛋白不含Th表位。二、目前治疗性抗体型疫苗还存在的技术问题1、内源性蛋白作为抗原面临低滴度的问题多肽和内源性蛋白作为抗原免疫不会产生抗体。短肽只有B表位而没有T表位，所以短肽免疫不能产生抗体，称之谓半抗原；内蛋白免疫动物或人一般情况下不能产生抗体，由于B细胞抗体基因不断突变可以产生针对内源性蛋白受体，但与内源性蛋白有高亲和力受体的B细胞则诱导凋亡，仅留下低亲和力受体的B细胞。另一方面，针对内源性蛋白的T细胞在发育过程中被清除而不能再生。内源性蛋白不能诱导动物或人产生高滴度抗体，称之谓B细胞免疫耐受。治疗性疫苗所采用的抗原通常选用人体或者动物的自身蛋白，或称内源性蛋白。为使多肽或内源性蛋白要产生抗体，现有的技术是与外源性强抗原蛋白，免疫学上称之谓免疫载体(immunocarrier)的蛋白化学偶联，引入外源性蛋白用于活化Th细胞。免疫载体蛋白常用的有：BSA、OVA、KLH、破伤风外毒素(TT)、乙肝、戊肝HIV病毒壳蛋白。除了将内源性蛋白与免疫载体(Immonocarrier)蛋白化学交联方法，用基因工程技术构建含有免疫载体的融合蛋白作为异源分子提供Th表位。也有用异种动物来源的同种蛋白提供Th表位。由此带来了新的问题：由于针对内源蛋白高亲和力的B细胞克隆清除，与外源载体蛋白表位高亲和结合的B细胞的丰度比与内源性蛋白表位结合的B细胞的丰度高几个数量级，从而存在交联蛋白(或融合蛋白)分子内蛋白表位免疫竞争的问题。当疫苗进入人体或动物体内，外源载体蛋白表位具有竞争优势，B细胞受体有更高机率结合外源载体蛋白表位并吞噬，产生针对外源载体蛋白的高滴度抗体。而内源性蛋白的相应抗体受抑制，只能产生低滴度抗体，很难实现临床治疗价值。2、特异性问题：只有产生高滴度抗体才能起到治作用。如果以外源性蛋白提供Th表位，除了引入上述竞争性抑外，更高滴度外源蛋白抗体因抗体会产生交叉反应可以产生无法预测副反应。3、人类HLA多样性动物试验中多数用纯种动物。在常用实验动物中小以鼠为例，表达MHCⅡ的基因H2就是H2-IAb。H2-IAdH2-IEaH2-IEb几种。人类HLA复合体是迄今已知的人体最复杂的基因体系。分为HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ。前者与细胞免疫相关，后者与抗体免疫相关联。HLA-Ⅱ类基因区十分复杂，主要包括HLA-DP、DQ、DR三个亚区和新近确定的DN、DO、DM等3个亚区。该区的基因是以它们所编码的肽链(α、β)直接命名，如DRA、DRB1、DRB2等。2014年公布的HLA-Ⅱ类等位基因型表达的蛋白多达1915种，而且每年有新发现。MHCⅡ由α链和、β链组成，有不同等位基因的αβ链组合，多样要性以万计数。几乎没有一种天然蛋白可以提供如此多的样的MHCⅡ结合多肽满足广泛人群疫苗制备。专利申请文献CN102008619A公开了一种克服B细胞免疫耐受的免疫微球及其应用。该对比文件主要针对的是现有技术中心化学交联蛋白或融合蛋白分子内表位的免疫竞争问题。其采用了免疫微球来解决上述问题，在微球介质的外部包覆疫苗抗原，内部包裹有用于活化T细胞的免疫载体蛋白。进一步的，疫苗抗原的B细胞表位位于免疫微球的表面，免疫载体蛋白的T细胞表位位于所述免疫微球的内部。该方法通过将抗原蛋白及免疫载体蛋白分置于微球表面及内部，避免了抗原蛋白表位与Th细胞活化表位同B细胞受体的竞争。该技术存在的问题是：微球内的蛋白容易从微球中漏出来，产生针对载体蛋白高滴度抗体。另一方面，该申请仅仅产生抗体免疫效应。[
技术实现思路
]本专利技术的目的在于解决现有技术中的上述问题。为了实现上述目的，提供一种充分多样的双亲性MHCII结合多肽，其特征在于序列结构为：脂肪酰-β折叠肽-C-MHCⅡ结合多肽-亲水型β折叠肽-马来酰亚胺，序列结构中所述的脂肪酰与C之间的β折叠肽是由5-8个疏水氨基酸构成的序列，所述的亲水型β折叠肽由酸性氨基酸与碱性氨基酸交错组成长度3-5的序列，所述的MHCII的结合多肽的序列是与MHCII具有亲和力的多肽序列或MHCII的随机取代序列，随机取代序列中用于随机取代的氨基酸是与取代位置亲水性相近的氨基酸，构成MHCII本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种充分多样的双亲性MHC II结合多肽，其特征在于序列结构为：脂肪酰‑β折叠肽‑C‑MHCⅡ结合多肽‑亲水型β折叠肽‑马来酰亚胺，序列结构中脂肪酰与C之间的β折叠肽是由5‑8个疏水氨基酸构成的序列，所述的亲水型β折叠肽由酸性氨基酸与碱性氨基酸交错组成长度3‑5的序列，所述的MHC II结合多肽的序列是与MHC II具有亲和力的多肽序列或MHC II的随机取代序列，随机取代序列中用于随机取代的氨基酸是与取代位置亲水性相近的氨基酸，所述的偶联基团用于与抗原偶联。

【技术特征摘要】
2018.02.14 CN 20181015147631.一种充分多样的双亲性MHCII结合多肽，其特征在于序列结构为：脂肪酰-β折叠肽-C-MHCⅡ结合多肽-亲水型β折叠肽-马来酰亚胺，序列结构中脂肪酰与C之间的β折叠肽是由5-8个疏水氨基酸构成的序列，所述的亲水型β折叠肽由酸性氨基酸与碱性氨基酸交错组成长度3-5的序列，所述的MHCII结合多肽的序列是与MHCII具有亲和力的多肽序列或MHCII的随机取代序列，随机取代序列中用于随机取代的氨基酸是与取代位置亲水性相近的氨基酸，所述的偶联基团用于与抗原偶联。2.一种免疫载体微球的制备方法，其特征在于权利要求1所述的双亲性MHCII结合多肽通过自组装形成免疫载体微球，MHCII结合多肽在微球中，偶联基团位于微球表面。3.如权利要求2所述的免疫载体微球的制备方法，其特征在于所述的组装通过以下方法中的一种实现：a.在有机溶剂/水混合溶剂中自组装，或b.通过模板自组装，或c.通过生物凝胶微球包裹的多肽自组装。4.如权利要求3所述的免疫载体微球的制备方法，其特征在于所述的在有机溶剂/水混合溶剂为乙腈/水混合溶剂，双亲性MHCII结合多肽加入到该混合溶剂中后通过搅拌形成乳液，双亲性MHCII结合多肽通疏水端...

【专利技术属性】
技术研发人员：谈立松，
申请(专利权)人：上海微球生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31