一种温敏性聚合物L64-IDA-Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种温敏性聚合物L64‑IDA‑Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法，属于分离纯化技术领域。本发明专利技术首先制备温敏性的聚合物L64‑IDA‑Cu(II)，然后将其作为捕集剂用于分离纯化菠萝蛋白酶，本发明专利技术制备合成的聚合物在温度高于其低临界溶解温度时，会自缔合而形成胶束，既避免结合的酶分子间的相互聚集导致酶活的损失，又能从溶剂中分离出来；当温度低于LCST时，胶束又展开释放菠萝蛋白酶的同时恢复到原始状态，易于将聚合物沉淀析出从而纯化菠萝蛋白酶；该合成物具有很好的重复利用性；并且本发明专利技术中使用的分离纯化方法操作简便，酶活损失少且对环境无污染。

A Thermosensitive Polymer L64-IDA-Cu(II) and a Method for Separation and Purification of Bromelain

The invention relates to a temperature-sensitive polymer L64 IDA Cu (II) and a method for separating and purifying bromelain, belonging to the technical field of separation and purification. The temperature-sensitive polymer L64 IDA Cu (II) is prepared and used as a collector for the separation and purification of bromelain. When the temperature of the prepared polymer is higher than its low critical dissolution temperature, the polymer will self-associate to form micelles, avoiding the loss of enzyme activity caused by the aggregation of the bound enzyme molecules, and can be separated from the solvent when the temperature is lower. When LCST is used, the micelles release bromelain and recover to the original state at the same time, which makes it easy to precipitate the polymer and purify bromelain; the syntheses have good reusability; and the separation and purification method used in the present invention is simple and easy to operate, with little loss of enzyme activity and no pollution to the environment.

【技术实现步骤摘要】
一种温敏性聚合物L64-IDA-Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法
本专利技术涉及一种温敏性聚合物L64-IDA-Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法，属于分离纯化

技术介绍
菠萝蛋白酶，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶，是从菠萝的果茎，叶，皮，芯中提取出来，再应用于各个行业，在食品加工业中，提高烘焙口感，使肉类嫩化。在美容行业中，具有嫩肤，美白祛斑的优异功效。在医药行业，科学家们已经开展了药理学研究调查，研究发现该酶能抑制肿瘤细胞的生长，治疗心血管疾病，还具有消炎作用。工业生产上对菠萝蛋白酶的制备主要是从菠萝的下脚料中提取，主要的制备工艺有高岭土吸附法、单宁沉淀法、盐析法和沉淀法等。这些方法都普遍存在一些不足之处，如工艺流程较长，原料消耗较多，酶活总回收滤较低等。而且，这些方法通常需要利用有机化学试剂作为溶剂和高温调节，这可能导致目标蛋白的构象发生变化，引发变质。因此，迫切需要开发出更高效，生物相容性好的提取菠萝蛋白酶技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前菠萝蛋白酶提取工艺复杂，酶活损失严重，污染环境等缺陷，提供一种新型的分离纯化菠萝蛋白酶的新方法，该方法具有操作简便，特异性高，分离效果好，酶活损失少，生产成本低，且材料可循环使用等优点。本专利技术采取的技术手段如下：本专利技术首先提供一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)，即三嵌段聚合物L64（(乙二醇)13(丙二醇)30(乙二醇)13）、亚氨基二乙酸、铜离子鳌合合成的聚合物，记为L64-IDA-Cu(II)。本专利技术还提供所述温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，具体方法如下：（1）三嵌段聚合物L64（(乙二醇)13(丙二醇)30(乙二醇)13）的环氧化：称量一定量的L64和环氧氯丙烷加入圆底烧瓶，慢慢滴加三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%的三氟化硼BF3）并于冰水浴（保持在0℃下）搅拌过夜。冰浴，维持搅拌，滴加NaOH，并再次于冰水浴下搅拌约5h。所述L64和环氧氯丙烷的质量比为15-25：0.5-0.9；所述三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%BF3）用量为0.75-1.25mL；所述滴加的NaOH的量为3-5mL，质量分数为40%。（2）L64与亚氨基二乙酸（IDA）的偶联（L64-IDA）：称量一定量环氧化的L64，加入NaOH调节pH后，加入IDA，搅拌条件下水浴；再加入Na2SO4，反应物成两相，用分液漏斗收集上相的富L64相，加热再次分成两相；收集下相中L64，用水稀释，并再次分相收集下相，即得到L64-IDA。所述环氧化的L64用量为15-25g；所述调节pH7-12.5，所述NaOH的浓度为0.2M；所述IDA加入量为1.0-1.7g；所述搅拌条件下水浴为48℃下搅拌水浴20h；所述Na2SO4的用量7.5-12.5g；所述分相条件为在65℃条件下分相。（3）螯合金属离子（L64-IDA-Cu(II)的合成）：L64-IDA中加入CuSO4溶解于一定量的醋酸钠缓冲溶液中，室温下搅拌；之后将溶液用氯仿萃取，氯仿相合并，蒸发溶剂；产物用水稀释，温度诱导分相，得终产物。所述L64-IDA、CuSO4和醋酸钠缓冲溶液的用量为7.5-12.5g：2.25-3.75g：37.5-62.5mL；其中醋酸钠缓冲溶液为浓度为50mM、pH值为4.0；所述室温下搅拌10h；所述分相条件为65℃条件下分相。本专利技术还提供一种循环高效分离纯化菠萝蛋白酶的方法，所述方法中以所述温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)为捕集剂，具体步骤如下：（1）L64-IDA-Cu(II)结合双水相浮选分离菠萝蛋白酶：将含有磷酸氢二钾（K2HPO4）和菠萝蛋白酶的溶液中加入所述的L64-IDA-Cu(II)作为捕集剂混合作为下相，上相为溴化1-丁基-3-甲基咪唑（[Bmim]Br），浮选，分别收集浮选到含L64-IDA-Cu(II)-菠萝蛋白酶复合物的上相和下相的盐溶液，测定浮选后上相和下相中的酶活和蛋白含量；所述下相和上相的体积比为50:3-5；其中，下相中磷酸氢二钾（K2HPO4）浓度为0.4-0.6g/mL，菠萝蛋白酶浓度为0.4-0.6mg/mL，L64-IDA-Cu(II)浓度为0.2-0.4g/L；所述上相溴化1-丁基-3-甲基咪唑（[Bmim]Br）的质量分数为50%-70%。所述浮选条件为在流速为20-40mL/min条件下浮选20-40min。（2）L64-IDA-Cu(II)结合两步沉淀纯化菠萝蛋白酶：在步骤（1）中收集到的上相混合溶液加入硫酸铵(NH4)2SO4作为分相盐，加热分相，此时的上相为[Bmim]Br溶液，下相为L64-IDA-Cu(II)-菠萝蛋白酶的复合物溶液；在下相中加入咪唑进行洗脱，加热分相，此时上相为含菠萝蛋白酶的水溶液，而下相为含L64-IDA-Cu(II)-咪唑复合物的溶液。所述上相中硫酸铵(NH4)2SO4的质量浓度为9%-11%；所述加入硫酸铵(NH4)2SO4后分相条件为40℃下加热30分钟；所述下相中咪唑浓度为0.4-0.6M；所述加入咪唑后分相条件为60℃下加热30分钟。本专利技术采用的双水相浮选（ATPF）是一种基于双水相体系（ATPS）和溶剂沉降（SS）的综合分离方法，是一种新的生物制品回收方法。ATPF可以减少后续下游加工步骤，这使得蛋白质含量或其生物活性的损失明显最小化。由于工业对绿色和清洁技术的巨大需求，具有非挥发性，不可燃性和高热稳定性的离子液体（ILs）作为ATPF中的相形成成分已变得越来越流行。此外，由于阳离子和阴离子的可变化性，ILs通常具有可调节的物理化学性质，因此经常被认为是可设计溶剂。基于ILs的ATPF用于从菠萝皮的粗提取物中分离和纯化菠萝蛋白酶。ATPF的捕集剂即合成的具有温敏性能螯合金属铜离子的聚合物是成功浮选的关键控制点。一方面，捕集剂上螯合的铜离子具有对菠萝蛋白酶的选择性识别。另一方面，捕集剂和菠萝蛋白酶的组合容易从系统中分离和回收。金属螯合物亲和力是通过利用金属离子和目标蛋白质分子中的组氨酸，半胱氨酸或色氨酸的残疾上的电子供体基团之间的相互作用来实现对目标蛋白质的选择性识别作用。温敏聚合物已广泛用于生物分离和生物加工。通过在聚合物的下临界溶解温度（LCST）以上加热，它们可以非常容易地与水溶液分离，从而实现对酶的保护作用。本专利技术涉及的一种具有温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)，并将其结合ILs和ATPF实现对菠萝蛋白酶的分离纯化。以亚氨基二乙酸IDA作为辅助借以连接温敏聚合物L64和金属铜离子，以实现对菠萝蛋白酶的吸附，此外L64的温敏性能还能在后续步骤中运用以达到纯化的目的。分离纯化后的菠萝蛋白酶通过紫外可见分光光度计UV-vis、傅里叶变换红外光谱仪FT-IR和圆二色谱CD对酶的二级结构进行分析，发现在纯化过程中并没有对酶造成破坏。本专利技术具有如下的优点：本专利技术中合成的温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)是分离纯化菠萝蛋白酶的关键控制点，一方面，在浮选分离菠萝蛋白酶实验中对目标酶具有选择性识别作用，另一方面，利用其温敏性能，合成物与目标酶的结合物在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64‑IDA‑Cu(II)，所述聚合物由三嵌段聚合物L64、亚氨基二乙酸、铜离子鳌合合成。

【技术特征摘要】
1.一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)，所述聚合物由三嵌段聚合物L64、亚氨基二乙酸、铜离子鳌合合成。2.一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，所述方法如下：（1）三嵌段聚合物L64的环氧化：称量一定量的L64和环氧氯丙烷加入圆底烧瓶，慢慢滴加三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%的三氟化硼BF3）并于冰水浴搅拌过夜；维持搅拌，滴加NaOH，并再次于冰水浴下搅拌数小时；（2）L64与亚氨基二乙酸（IDA）的偶联：称量一定量环氧化的L64，加入NaOH调节pH后，加入IDA，搅拌条件下水浴；再加入Na2SO4，反应物成两相，用分液漏斗收集上相的富L64相，加热再次分成两相；收集下相中L64，用水稀释，并再次分相收集下相，得到偶联IDA的L64；（3）偶联IDA的L64螯合Cu(II)，得到聚合物：L64-IDA中加入CuSO4溶解于一定量的醋酸钠缓冲溶液中，室温下搅拌；之后将溶液用氯仿萃取，氯仿相合并，蒸发溶剂；产物用水稀释，温度诱导分相，得终产物。3.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述L64和环氧氯丙烷的质量比为15-25：0.5-0.9；所述三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%BF3）用量为0.75-1.25mL；所述滴加的NaOH的量为3-5mL，质量分数为40%。4.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述环氧化的L64、IDA和Na2SO4的用量以质量比计为15-25：1.0-1.7：7.5-12.5。5.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述调节pH为7-12.5；所述搅拌条件下水浴为48℃下搅拌水浴20h；所述分相条件为在65℃条件下分相。6.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗鹏，韩娟，王赟，李春梅，王蕾，倪良，蔡云凤，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32