一种幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物的合成制造技术

本发明专利技术公开了一种幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物的合成，属于有机合成领域。本发明专利技术通过化学合成得到幽门螺旋杆菌O2血清型O‑抗原二糖至二十四糖。本发明专利技术利用保护剂策略、温度效应、溶剂效应和添加剂效应，开发了一种非常有利于葡萄糖α糖苷键生成的化学合成方法。将此方法用于合成组装有氨基连接臂的幽门螺旋杆菌O2血清型O‑抗原寡糖类化合物；合成得到的组装有氨基连接臂的幽门螺旋杆菌O2血清型O‑抗原寡糖类化合物可以与载体蛋白制成糖缀合物，用于免疫学研究，对发展预防和治疗幽门螺旋杆菌具有重要作用。

Synthesis of an Oligosaccharide Compound of Serotype O Antigen of Helicobacter pylori

The invention discloses the synthesis of an oligosaccharide compound of Helicobacter pylori serotype O antigen, belonging to the field of organic synthesis. The present invention synthesizes H. pylori serotype O antigen disaccharides to 24 sugars by chemical synthesis. The present invention utilizes protective agent strategy, temperature effect, solvent effect and additive effect to develop a chemical synthesis method which is very conducive to the formation of glucose alpha glycoside bond. This method was used to synthesize O_antigen oligosaccharides of Helicobacter pylori serotype O_with amino-linked arms. The O_antigen oligosaccharides of Helicobacter pylori serotype O_antigen with amino-linked arms could be synthesized into glycoconjugates with carrier proteins for immunological research and play an important role in the development of prevention and treatment of Helicobacter pylori.

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物的合成
本专利技术涉及一种幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物的合成，属于有机合成领域。
技术介绍
幽门螺旋杆菌是一种微需氧型的革兰氏阴性菌，全球约有一半人口感染了这种致病菌，因为较低的社会经济地位和较差的医疗卫生条件，在发展中国家中这一比例更是高达80％，据报道在我国城市和农村分别有47％和66％的人口感染了幽门螺旋杆菌。口-口传播和粪-口传播是该致病菌最主要的传播方式，母婴传播也是该致病菌的传播方式之一。大部分的幽门螺旋菌的感染发生儿童时期，一旦感染，治病菌可能在胃粘膜上存在一生。尽管70％的被感染者在临床上是无症状的，但是这种致病菌已经被证实与一系列胃肠道疾病有关，15％-20％的长期感染者将会引发胃炎，胃和十二指肠溃疡等一系列胃肠道疾病，另外还有1％-2％的长期感染者将发展成胃癌。胃癌已成为全球发病率第五高(～952000例，占癌症病人的6.2％，2012年WHO数据)和死亡率第三高的癌症(～723000例，占癌症病人的8.8％，2012年WHO数据)1994年WHO下属的国际癌症研究机构(IACR)将幽门螺旋杆菌分类为I类致癌物。目前针对幽门螺旋杆菌感染相关的胃肠道疾病的主要治疗方法是一种利用两种抗生素(甲硝咪唑和克拉霉素)和一种质子泵抑制剂的联合治疗方法，称之为三联疗法。这种方法在治疗幽门螺旋杆菌上取得了一定的效果，但是仍有不少不足之处，主要限制表现在：1)抗生素在胃肠道中的代谢时间比较短，2)抗生素在胃这种特殊pH低环境下相对不稳定，3)幽门螺杆菌一般寄居在胃黏膜处，而抗生素浓度在黏膜浓度很低，4)更重要的是随着耐药性细菌的出现抗生素的治疗效果有逐渐减弱的趋势。基于以上缺陷，有报道使用三联疗法治疗后的幽门螺旋杆菌的一年复发率已达15％-30％。因此，为了克服这一缺陷，研究针对这一致病菌的疫苗相关研究越来越受到重视。近年来，针对幽门螺旋杆菌疫苗的研究表现在的毒力因素抗原上，如尿酶B，细胞毒素相关毒素(CagA)，空泡毒素(VacA)，鞭毛，热休克蛋白，黏附素，中性粒细胞活性蛋白等。另外，针对灭活全菌细胞和菌溶产物的研究也是疫苗的热点之一。与其他革兰氏阴性菌一样，幽门螺旋杆菌的细胞表面主要是有脂多糖组成，脂多糖对该细菌的生物膜结构和功能的完整性具有相当重要的作用，也存在于细菌的分泌物中，是该细菌的致病因素和毒力因素之一。Monteiro系统地研究了各类幽门螺旋杆菌的脂多糖结构发现其结构与典型的革兰氏阴性菌一致，包含三个不同的结构单元，分别是多聚糖O糖链，核心寡糖链和富含脂肪酸的脂质A。在幽门螺旋杆菌中，核心寡糖链结构相对保守而多聚糖O糖链表现出特异性的表型。根据多聚糖O糖链中具体单糖种类和连接方式的不同可以将幽门螺旋杆菌分类6种不同的血清型(O1-O6)。2015年Monteiro报道了幽门螺旋杆菌的O2血清型O聚糖链的具体结构，该血清型的O-抗原是由葡萄糖残基依次通过α-(1→2)-和α-(1→3)-糖苷键依次连接而成的重复单元结构，最长可达12个重复单元的24糖链。目前针对幽门螺旋杆菌脂多糖的研究主要是通过从灭活细菌中提取，这一方法的不足在于一次提取得到的产物极少，另外受细菌基因表达和修饰的特性，提取得到的脂多糖也存在结构不够专一，并且容易附带结构类似杂质的特点，实验重复性差，对研究存在一定的干扰。我们利用化学合成方法，以幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖为目标化合物，通过糖基砌块的设计和构建以及糖基化反应的选择和优化得到O抗原二糖，四糖和六糖，并且所合成的二糖，四糖和六糖还原端均组装有氨基连接臂，可以与载体蛋白连接成糖缀合物，开展进一步的免疫学研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是通过化学方法合成幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖片段。α-1,2顺式糖苷键的构建是合成目标结构的关键步骤。本专利技术利用二丙酮葡萄糖为唯一起始原料通过糖基砌块的构建和糖基化反应条件的优化最终得到保护的全α连接的保护二，四，六糖，最终脱去保护得到最后的目标化合物组装有氨基连接臂的幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原二糖，四糖和六糖。同时，用该方法合成得到的二糖，四糖和六糖还原端均组装有氨基连接臂，可以和载体蛋白结合用于免疫学研究。其中m为二糖片段的重复单元数，可以为2～12；R为-(CH2)n-N-Y1Y2或者-(CH2)n-N-Y1Y2(linker)，n＝1～10，N为氮Y1为氢(H)或者烷氧基如苄基(Bn)，Y2为氢(H)或者烷氧羰基如苄甲氧羰基(Cbz)，R1，R2，R3，R4，R5，R6为氢或者醚类基团如苄基(Bn)。本专利技术的第一个目的是提供一种幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物的制备方法，所述方法利用糖砌块A、B、C构建幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物，包括构建糖砌块之间的1,2-α-顺式-糖苷键和1,3-α-顺式-糖苷键；其中糖砌块A、B、C分别为结构式II、III所示的化合物：其中，LG为糖基化反应离去基团，包括三氯乙酰亚胺基、对甲基苯硫基；linker包括-(CH2)n-N-Y1Y2或者-(CH2)n-N-Y1Y2(linker)，Y1为氢(H)或者烷氧基如苄基(Bn)，Y2为氢(H)或者烷氧羰基如苄甲氧羰基(Cbz)；R1，R2，R3，R4，R5，R6为氢或者醚类基团；R7为氢或者酰基类基团。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法中1,3-α-顺式-糖苷键的构建是在二氯甲烷和乙醚的混合溶剂中进行的。在本专利技术的一种实施方式中，所述混合溶剂中二氯甲烷与乙醚的体积比为1：(2.5-5)。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法中1,3-α-顺式-糖苷键的构建还需要引入添加剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述添加剂包括噻吩。在本专利技术的一种实施方式中，所述添加剂与糖切块的摩尔比为(80-120)：1。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法中1,2-α-顺式-糖苷键的构建是在二氯甲烷溶剂中进行的。在本专利技术的一种实施方式中，1,3-葡萄糖α糖苷键的构建方法优选：糖基供体和糖基受体在甲苯中共沸，加入二氯甲烷和乙醚，反应底物的浓度为0.01～0.1M，以分子筛作为干燥剂，加入相当于糖基供体当量100倍的噻吩，在室温下搅拌30min后冷却至0℃，反应时间为12h，用吡啶终止反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：(1)合成葡萄糖单糖砌块A、B、C；(2)合成二糖化合物：构建糖砌之间的1,2-α-顺式-糖苷键；(3)合成四糖化合物：构建步骤(2)所得二糖化合物之间的1,3-α-顺式-糖苷键。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还包括：参照步骤(3)，构建多糖化合物与多糖化合物之间的1,3-α-顺式-糖苷键，制备得到幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物；所述多糖化合物为式IV所示的化合物；其中，m为二糖片段的重复单元数，为2～12；linker包括-(CH2)n-N-Y1Y2或者-(CH2)n-N-Y1Y2(linker)，Y1为氢(H)或者烷氧基如苄基(Bn)，Y2为氢(H)或者烷氧羰基如苄甲氧羰基(Cbz)；R1，R2，R3，R4，R5，R6为氢或者醚类基团；R7为氢或者酰基类基团。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中单糖砌块A的合成方法包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物的合成方法，其特征在于，所述方法是利用糖砌块A、B、C构建幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物，包括构建糖砌块之间的1,2‑α‑顺式‑糖苷键和1,3‑α‑顺式‑糖苷键；其中糖砌块A、B、C分别为结构式II、III所示的化合物：

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物的合成方法，其特征在于，所述方法是利用糖砌块A、B、C构建幽门螺旋杆菌O2血清型O抗原寡糖类化合物，包括构建糖砌块之间的1,2-α-顺式-糖苷键和1,3-α-顺式-糖苷键；其中糖砌块A、B、C分别为结构式II、III所示的化合物：其中，LG为糖基化反应离去基团，包括三氯乙酰亚胺基、对甲基苯硫基；linker包括-(CH2)n-N-Y1Y2或者-(CH2)n-N-Y1Y2(linker)，Y1为氢或者烷氧基，Y2为氢或者烷氧羰基；R1，R2，R3，R4，R5，R6为氢或者醚类基团；R7为氢或者酰基类基团。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中1,3-α-顺式-糖苷键的构建是在二氯甲烷和乙醚的混合溶剂中进行的。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合溶剂中二氯甲烷与乙醚的体积比为1：(2.5-5)。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述方法中1,3-α-顺式-糖苷键的构建还需要引入添加剂。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述添加剂与糖砌块的摩尔比为(80-120)：1。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述添加剂包括噻吩。7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹健，胡静，刘中华，秦春君，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32