同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒。上述四类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌和赭曲霉毒素产生菌。基于多重PCR检测方法，包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对。本发明专利技术建立了一种不经过分离纯化，直接检测中药材污染产毒真菌的多重PCR体系，各引物特异性强，方法的检出限为10

Multiplex PCR Primers, Methods and Kits for Simultaneous Detection of Four Kinds of Toxic Fungi Contaminated by Traditional Chinese Medicine

The invention discloses multiplex PCR primers, methods and kits for simultaneously detecting four kinds of toxic fungi contaminated by Chinese medicinal materials. These four kinds of toxin-producing fungi are aflatoxin-producing fungi, heterochromatoxin-producing fungi and ochratoxin-producing fungi. Multiplex polymerase chain reaction (PCR) based detection methods include the first primer pair, the second primer pair, the third primer pair and the fourth primer pair, which can carry out the PCR reaction in the same reactor tube. The invention establishes a multiplex PCR system for direct detection of toxic fungi contaminated by Chinese medicinal materials without separation and purification. Each primer has strong specificity, and the detection limit of the method is 10.

【技术实现步骤摘要】
同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒
本专利技术涉及同时检测4类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒，属于生物技术检测领域，特别涉及同时检测中药材污染4类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒。
技术介绍
中药材受自身性质(含有大量淀粉、多糖等)的影响，在生产、加工、运输、贮存过程中，很容易污染各种真菌而发生霉变，不但药效价值降低，人误服后会引起中毒。针对上述中药材受真菌污染问题，我国已经制定了若干管理规范，但污染检测方面仍然存在许多空白。例如《中国药典》仅对强致癌物黄曲霉毒素规定了检测方法和限量标准，《中国药典》2015年版一部收录了桃仁等十九味中药中黄曲霉毒素的检测方法，而对赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素等其他多种真菌毒素没有相应的限量要求，也缺乏相应的数据支持。虽然目前已经对真菌毒素出台了相关限量标准。然而，真菌毒素的检测方法只能在真菌产生真菌毒素的情况下才能发挥作用，无法在产毒真菌尚未产生真菌毒素时，主动采取相关防范措施。一旦所检中药材的真菌毒素含量超标，只能采取抛弃等被动处理方法，很容易造成资源浪费。因此，建立一种针对中药材污染真菌的预警方法是非常必要的。目前，在产毒真菌的种类检测和鉴定方面已有深入的研究和广泛的应用。比较成熟的方法是多聚酶链式反应(PCR)技术、分子标记技术等。其中，PCR技术是建立中药材污染真菌的检测方法的有效手段。多重PCR检测技术，是指在一个PCR反应体系中加入两对或者两对以上引物，能够同时扩增出多个DNA片段，具有高效、快速、经济等优点。国内外均有不少研究报道。实现多重PCR检测，引物的设计极为关键，直接影响着方法的特异性。例如：在赭曲霉毒素生物合成途径基因PKS设计引物AoLC3512L/AoLC3512R和AoOTAL/AoOTAR，其中AoLC35-12L/AoLC35-12R引物仅仅对产赭曲霉毒素产生菌特异性，该二重PCR检测方法成功鉴别赭曲霉毒素产生菌与不产毒菌株。Rodríguez等根据fluG该基因设计了特异性引物F-FluGc/R-FluGc，建立的多重实时荧光定量PCR，成功鉴别产杂色曲霉毒素菌株与不产毒菌株。秦文彦等根据黄曲霉毒素生物合成途径中aflR、ver-1、omtA-1等基因上设计引物，成功建立了多重PCR检测方法，并应用于食品及饲料表面中污染的黄曲霉菌和寄生曲霉菌的检测。结果显示，aflR、ver-1和omt-1基因上设计的引物能够扩增出相应大小、清晰明亮的电泳条带。而其余如青霉、烟曲霉、杂色曲霉和黑曲霉菌株的样品只检测出真菌保守区域共有的ITS片段。上述文献报道均仅仅针对一类产毒真菌，例如黄曲霉毒素产生菌、赭曲霉毒素产生菌或者杂色曲霉毒素产生菌，而对于该四类产毒真菌之间的组合的检测方法的相关报道甚少。目前，针对产毒真菌分子鉴定方法很多，但仅仅针对一类产毒真菌或者两类产毒真菌，检测范围小，没有系统性对中药材受产毒真菌污染的情况进行详细的分析。传统的中药材污染产毒真菌分子鉴定方法需在菌株分离、纯化的基础上进行种属的鉴定以及产毒性能的分析，操作步骤多、周期长，无法做出及时的判断，更无法对中药材在加工、生产过程中真菌的污染水平进行监控。目前尚未见不经过分离纯化，直接对中药材污染产毒真菌进行多重PCR检测分析。目前产毒真菌DNA的提取方法主要有NaOH裂解法、Chelex-100裂解法、CTAB法等，不仅经济实惠，而且提取效率高。综上所述，在食品及农产品中污染的产毒真菌的分子鉴定方法(单重PCR和多重PCR)，已经是非常成熟。但是，对于中药材感染产毒真菌的多重PCR方法研究相对较少，尚未成熟，原因之一是中药材基质比较复杂。因此，建立一种针对中药材污染产毒真菌的多重PCR快速鉴定方法是非常必要的。应用多重PCR技术，不经过菌株分离纯化，直接鉴别中药材的产毒真菌污染情况，是今后对药材产毒真菌污染检测技术的发展趋势，同时是本专利技术的主要研究目标。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术目的是主要针对黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素4种主要毒素的产生菌，提供同时检测中药材污染4类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒。本专利技术建立了一种不经过分离纯化，直接检测中药材表面污染产毒真菌的多重PCR体系。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供同时检测中药材污染4类产毒真菌的多重PCR引物，上述4类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌和赭曲霉毒素产生菌、伏马菌素产生菌，包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对，第五引物对，其中，第一引物对用以扩增真菌rDNA基因Wen，包括正向引物Wen2F和反向引物Wen2R，分别包括SEQIDNO.01和SEQIDNO.02所示的序列；正向引物Wen2F为5’-TTCCATGCGAGCCCAACCTCCC-3’，反向引物Wen2R为5’-AGGGGACGACGACCCAAACA-3’，扩增产物大小为370bp；第二引物对用以扩增黄曲霉毒素合成基因AF，包括正向引物AF-1F和反向引物AF-1R，分别包括SEQIDNO.03和SEQIDNO.04所示的序列；正向引物AF-1F为5’-GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC-3’，反向引物AF-1R为5’-GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG-3’，扩增产物大小为780bp；第三引物对用以扩增黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素共同的合成基因AFST，包括正向引物AFST-1F和反向引物AFST-1R，分别包括SEQIDNO.05和SEQIDNO.06所示的序列；正向引物AFST-1F为5’-GGCCCTTGTGGTGGGGTTCAAATCGGTGA-3’，反向引物AFST-1R为5’-CTTAGGTGACGACTTGGCGGGCTTTGATC-3’，扩增产物大小为1400bp；第四引物对用以扩增赭曲霉毒素合成基因OTA，包括正向引物OTA-1F和反向引物OTA-1R，分别包括SEQIDNO.07和SEQIDNO.08所示的序列；正向引物OTA-1F为5’-GCCAGACCATCGACACTGCATGCTC-3’，反向引物OTA-1R为5’-CGACTGGCGTTCCAGTACCATGAGCC-3’，扩增产物大小为540bp；第五引物对用以扩增伏马菌素合成基因Fum，包括正向引物Fum-1F和反向引物FB-1R，分别包括SEQIDNO.09和SEQIDNO.10所示的序列；正向引物FB-F为5’-GAGCTTGTCCTTCTCACTGG-3’，反向引物FB-R为5’-GAGCCGACATCATAATCAGT-3’。本专利技术提供上述多重PCR引物在制备同时检测中药材污染4类产毒真菌的试剂或器械中的应用；所述4类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌和赭曲霉毒素产生菌、伏马菌素产生菌。本专利技术提供同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR方法，上述四类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌、赭曲霉毒素产生菌和伏马菌素产生菌，所述多重PCR方法包括以下步骤：1)提取、纯化产毒菌DNA，采用改良的CTAB法，作为模板DNA；所述改良的CTAB法为CTAB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物，上述四类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌、伏马菌素产生菌和赭曲霉毒素产生菌，其特征在于：包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对，其中，第一引物对用以扩增真菌rDNA基因Wen，包括正向引物Wen2F和反向引物Wen2R，分别包括SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02所示的序列；正向引物Wen2F为5’‑TTCCATGCGAGCCCAACCTCCC‑3’，反向引物Wen2R为5’‑AGGGGACGACGACCCAAACA‑3’；第二引物对用以扩增黄曲霉毒素合成基因AF，包括正向引物AF‑1F和反向引物AF‑1R，分别包括SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04所示的序列；正向引物AF‑1F为5’‑GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC‑3’，反向引物AF‑1R为5’‑GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG‑3’；第三引物对用以扩增黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素共同的合成基因AFST，包括正向引物AFST‑1F和反向引物AFST‑1R，分别包括SEQ ID NO.05和SEQ ID NO.06所示的序列；正向引物AFST‑1F为5’‑GGCCCTTGTGGTGGGGTTCAAATCGGTGA‑3’，反向引物AFST‑1R为5’‑CTTAGGTGACGACTTGGCGGGCTTTGATC‑3’；第四引物对用以扩增赭曲霉毒素合成基因OTA，包括正向引物OTA‑1F和反向引物OTA‑1R，分别包括SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08所示的序列；正向引物OTA‑1F为5’‑GCCAGACCATCGACACTGCATGCTC‑3’，反向引物OTA‑1R为5’‑CGACTGGCGTTCCAGTACCATGAGCC‑3’；第五引物对用以扩增伏马菌素合成基因Fum，包括正向引物Fum‑1F和反向引物FB‑1R，分别包括SEQ ID NO.09和SEQ ID NO.10所示的序列；正向引物FB‑F为5’‑GAGCTTGTCCTTCTCACTGG‑3’，反向引物FB‑R为5’‑GAGCCGACATCATAATCAGT‑3’。...

【技术特征摘要】
1.同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物，上述四类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌、伏马菌素产生菌和赭曲霉毒素产生菌，其特征在于：包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对，其中，第一引物对用以扩增真菌rDNA基因Wen，包括正向引物Wen2F和反向引物Wen2R，分别包括SEQIDNO.01和SEQIDNO.02所示的序列；正向引物Wen2F为5’-TTCCATGCGAGCCCAACCTCCC-3’，反向引物Wen2R为5’-AGGGGACGACGACCCAAACA-3’；第二引物对用以扩增黄曲霉毒素合成基因AF，包括正向引物AF-1F和反向引物AF-1R，分别包括SEQIDNO.03和SEQIDNO.04所示的序列；正向引物AF-1F为5’-GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC-3’，反向引物AF-1R为5’-GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG-3’；第三引物对用以扩增黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素共同的合成基因AFST，包括正向引物AFST-1F和反向引物AFST-1R，分别包括SEQIDNO.05和SEQIDNO.06所示的序列；正向引物AFST-1F为5’-GGCCCTTGTGGTGGGGTTCAAATCGGTGA-3’，反向引物AFST-1R为5’-CTTAGGTGACGACTTGGCGGGCTTTGATC-3’；第四引物对用以扩增赭曲霉毒素合成基因OTA，包括正向引物OTA-1F和反向引物OTA-1R，分别包括SEQIDNO.07和SEQIDNO.08所示的序列；正向引物OTA-1F为5’-GCCAGACCATCGACACTGCATGCTC-3’，反向引物OTA-1R为5’-CGACTGGCGTTCCAGTACCATGAGCC-3’；第五引物对用以扩增伏马菌素合成基因Fum，包括正向引物Fum-1F和反向引物FB-1R，分别包括SEQIDNO.09和SEQIDNO.10所示的序列；正向引物FB-F为5’-GAGCTTGTCCTTCTCACTGG-3’，反向引物FB-R为5’-GAGCCGACATCATAATCAGT-3’。2.权利要求1所述的多重PCR引物在制备同时检测中药材污染四类产毒真菌的试剂或器械中的应用；所述四类产毒真菌分别为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌、伏马菌素产生菌和赭曲霉毒素产生菌。3.同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR方法，上述4类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌、伏马菌素产生菌和赭曲霉毒素产生菌，其特征在于，所述多重PCR方法包括以下步骤：1)提取、纯化产毒菌DNA，采用改良的CTAB法，作为模板DNA；所述改良的CTAB法为CTAB法结合核酸纯化柱；2)利用一组5对引物对、PCR体系对模板DNA进行多重PCR扩增；所述一组5对引物对包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对，其中，第一引物对用以扩增真菌rDNA基因Wen，包括正向引物Wen2F和反向引物Wen2R，分别包括SEQIDNO.01和SEQIDNO.02所示的序列；正向引物Wen2F为5’-TTCCATGCGAGCCCAACCTCCC-3’，反向引物Wen2R为5’-AGGGGACGACGACCCAAACA-3’；第二引物对用以扩增黄曲霉毒素合成基因AF，包括正向引物AF-1F和反向引物AF-1R，分别包括SEQIDNO.03和SEQIDNO.04所示的序列；正向引物AF-1F为5’-GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC-3’，反向引物AF-1R为5’-GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG-3’；第三引物对用以扩增黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素共同的合成基因AFST，包括正向引物AFST-1F和反向引物AFST-1R，分别包括SEQIDNO.05和SEQIDNO.06所示的序列；正向引物AFST-1F为5’-GGCCCTTGTGGTGGGGTTCAAATCGGTGA-3’，反向引物AFST-1R为5’-CTTAGGTGACGACTTGGCGGGCTTTGATC-3’；第四引物对用以扩增赭曲霉毒素合成基因OTA，包括正向引物OTA-1F和反向引物OTA-1R，分别包括SEQIDNO.07和SEQIDNO.08所示的序列；正向引物OTA-1F为5’-GCCAGACCATCGACACTGCATGCTC-3’，反向引物OTA-1R为5’-CGACTGGCGTTCCAGTACCATGAGCC-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晖，鲁晓芳，罗朝权，詹若挺，陈蔚文，王文丽，郑润生，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44