鉴别长梗黄精和多花黄精的特征序列、引物及方法技术

本发明专利技术涉及鉴别长梗黄精(Polygonatum filipe)和多花黄精(Polygonatum cyrtonema)的特征序列、特异性标记引物，以及快速鉴定的方法。所述特征序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物序列如下：上游引物CG_Fb：5′‑GACTGCGTACGAATTGTCGAT‑3′下游引物CG_Rb：5′‑AAACCGGTAGCCTTGAACG‑3′。本发明专利技术特征序列和分子特异性标记引物可对长梗黄精和多花黄精进行快速的鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别长梗黄精和多花黄精所不能替代的分子手段。

Characteristic Sequences, Primers and Methods for Identification of Polygonatum longissima and Polygonatum multiflorum

The present invention relates to characteristic sequences, specific marker primers and a rapid identification method for Polygonatum Filipe and Polygonatum cyrtonema. The characteristic sequence as shown in SEQ ID NO.1 is as follows: upstream primer CG_Fb:5'GACTGGTACGAATTGTCGAT_3', downstream primer CG_Rb:5' AAACCGTAGCCTTGAACG_3'. The characteristic sequence and molecular specific marker primers of the invention can quickly identify Polygonatum longissima and Polygonatum multiflorum. The method is simple, fast and accurate, and is an irreplaceable molecular means for identifying Polygonatum longissima and Polygonatum multiflorum by apparent characteristics.

【技术实现步骤摘要】
鉴别长梗黄精和多花黄精的特征序列、引物及方法(一)
本专利技术涉及一种鉴别长梗黄精(Polygonatumfilipe)和多花黄精(Polygonatumcyrtonema)的特征序列、特异性标记引物，以及一种利用该引物对两者进行准确辨别的方法。(二)
技术介绍
黄精，始载于《名医别录》，性味甘，平，归脾、肺、肾经。在临床上对治疗体倦乏力、脾胃气虚、肾虚亏损、肺虚燥咳、内热消渴、精血不足、须发早白、口干食少等有一定功效，有“血气双补之王”的美称，同时也可用于治疗肺结核、糖尿病、慢性肝炎等疾病，具有抗肿瘤、抗辐射等作用。黄精地下块茎富含多糖、皂苷、氨基酸、生物碱、微量元素等，具有很高的药用价值和食用价值。此外，黄精还可作为观赏植物开发利用。由此可见，黄精具有巨大的开发潜力和广阔的市场前景。长梗黄精(P.filipe)和多花黄精(P.cyrtonema)均属于百合科黄精属的多年生草本植物，在形态上具有相似性，通常人们依据黄精叶片的长宽比，叶背有无短毛，花梗长度以及花丝上端是否膨大等形态学特征作为判别依据。由于生长环境、气候条件、土壤养分及生长年限等因素的影响，即使同一种黄精生长在不同地区其形态特征也会存在一定差异，因此形态鉴别往往缺乏准确性。此外，黄精块茎作为其药食同源的主要材料，均为结节状或连珠状膨大，其显微特征也极为相似，更不易直接被鉴别。与此同时，多花黄精被纳入《中国药典》，作为黄精药用的其中一种基源植物，而长梗黄精则未被列入其中，市场上易发生将长梗黄精混淆为多花黄精的现象，给黄精的市场秩序和药用安全性等带来了一定的隐患。因此，为区别两种不同来源的黄精药材，有必要对其鉴别方法进行研究。目前，RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)和ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat，简单序列重复区间扩增多态性)分子标记技术已被用于黄精属植物的亲缘关系研究、种质资源鉴别和遗传多样性分析。这些分子标记技术均采用通用型引物，需要大量的引物筛选，且PCR扩增图谱的条带多，重复性较差，特异性不高。因此，只有发掘出可靠稳定的种特异性DNA指纹才能更有效地用于不同黄精种间的准确、快速鉴定。(三)
技术实现思路
本专利技术目的提供可鉴别长梗黄精和多花黄精的特征序列及分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对这两种不同的黄精进行快速辨别的方法。本专利技术采用的技术方案是：鉴别长梗黄精(Polygonatumfilipe)和多花黄精(Polygonatumcyrtonema)的特征序列，其序列如下：5′-GACTGCGTACGAATTGTCGATAGTATTTCCTTGCACTTACTGTTATTACTCCACGTGCTTCACTACACTCCTGTTACAACACATGAACTCTTATACTATTCATTATAACATTGACCTGTCACTGCCATTTATTTCTCTCTAGTCTTTATGAACTTTGTTCTACCTCTACTAGTCCCAATGGACCGTGCCGCTTAAGGCTACTAGGCATATTGGATATCGCTATCCATTTATACTGGTTCCCTTAGATTGCTTCGTTCCATTTCTACTAGTTCTCGTAGTCTCTGTTGCATTTCCACTAGCCCTCATGAACTCGTTCCATCTCTGCTAGTCCTAATGGACTTTGTCGTCCAAGGCTACTAGTCTTGTTGGATAGGCCATCCATTCGACTAGTCTCCATTGGGTTGCTTAGTTCATTTCTACTAGTCCTCTTGTACTTGAACCCACTTCAACTAGTCCTTATAGGCTTAGGACCATCTCCACTAGTTCCAGTGGACTTTGTCGTTCAAGGCTACCGGTTT-3′。鉴别长梗黄精和多花黄精的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物CG_Fb：5′-GACTGCGTACGAATTGTCGAT-3′，下游引物CG_Rb：5′-AAACCGGTAGCCTTGAACG-3′。该引物对是采用ISSR分子标记技术，经过PCR扩增，大量筛选获得长梗黄精的特异性DNA片段(SEQIDNo.1)之后，后将该片段克隆测序，并以DNA序列为基础设计其特异性引物，以该引物对长梗黄精和多花黄精进行PCR扩增，仅长梗黄精可稳定获得518bp大小的特异性片段，而多花黄精不能获得该特异性片段。本专利技术还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对长梗黄精和多花黄精进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测黄精样本的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现约518bp的DNA条带，则待测黄精样品为长梗黄精，若电泳结果未出现约518bp的DNA条带，则待测黄精样品为多花黄精；所述分子特异性标记引物序列为：上游引物CG_Fb：5′-GACTGCGTACGAATTGTCGAT-3′下游引物CG_Rb：5′-AAACCGGTAGCCTTGAACG-3′。所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。需要说明的是，本专利技术分子特异性标记引物仅限于长梗黄精和多花黄精的鉴定，即待测样品仅限于长梗黄精和多花黄精，本领域普通技术人员可根据黄精植株或块茎形态特征先进行初步的判断，再将判断可能为长梗黄精或多花黄精的样本用本专利技术方法进行鉴别。所述PCR扩增条件可如下：94℃预变性6min后；94℃变性30s，55.7℃退火45s，72℃延伸1.5min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。具体的，所述方法如下：(1)取待测黄精样品块茎洗净，切片，硅胶干燥，取适量加液氮磨碎，提取待测黄精样本块茎的基因组DNA；(2)对步骤(1)获得的样品基因组DNA进行核酸纯度及浓度的检测，OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增，并稀释基因组DNA浓度为20ng/μL用于后续检测；(3)以步骤(2)稀释的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：PCR反应体系每20μL组成如下：2×PowerTaqPCRMasterMix10μL10μM上、下游引物各1.5μL20ng/μL模板DNA3μLddH2O补足至20μL；PCR反应条件如下：94℃预变性6min后；94℃变性30s，55.7℃退火45s，72℃延伸1.5min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；(4)取步骤(3)扩增产物4μL，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中电泳40min(50～100mA，120V)，后于自动凝胶图像分析仪上照相；若电泳结果出现518bp的DNA条带，则待测样品为长梗黄精；若电泳结果未出现518bp的DNA条带，则待测样品为多花黄精。本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术分子特异性标记引物可用于长梗黄精和多花黄精植株或块茎的鉴别，方法简单、快捷、准确。虽然长梗黄精和多花黄精在植物叶片的形态特征上存在一定差异，但是块茎的形态差异并不显著，而黄精又以块本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鉴别长梗黄精(Polygonatum filipe)和多花黄精(Polygonatum cyrtonema)的特征序列，其序列如下：5′‑GACTGCGTACGAATTGTCGATAGTATTTCCTTGCACTTACTGTTATTACTCCACGTGCTTCACTACACTCCTGTTACAACACATGAACTCTTATACTATTCATTATAACATTGACCTGTCACTGCCATTTATTTCTCTCTAGTCTTTATGAACTTTGTTCTACCTCTACTAGTCCCAATGGACCGTGCCGCTTAAGGCTACTAGGCATATTGGATATCGCTATCCATTTATACTGGTTCCCTTAGATTGCTTCGTTCCATTTCTACTAGTTCTCGTAGTCTCTGTTGCATTTCCACTAGCCCTCATGAACTCGTTCCATCTCTGCTAGTCCTAATGGACTTTGTCGTCCAAGGCTACTAGTCTTGTTGGATAGGCCATCCATTCGACTAGTCTCCATTGGGTTGCTTAGTTCATTTCTACTAGTCCTCTTGTACTTGAACCCACTTCAACTAGTCCTTATAGGCTTAGGACCATCTCCACTAGTTCCAGTGGACTTTGTCGTTCAAGGCTACCGGTTT‑3′。...

【技术特征摘要】
1.鉴别长梗黄精(Polygonatumfilipe)和多花黄精(Polygonatumcyrtonema)的特征序列，其序列如下：5′-GACTGCGTACGAATTGTCGATAGTATTTCCTTGCACTTACTGTTATTACTCCACGTGCTTCACTACACTCCTGTTACAACACATGAACTCTTATACTATTCATTATAACATTGACCTGTCACTGCCATTTATTTCTCTCTAGTCTTTATGAACTTTGTTCTACCTCTACTAGTCCCAATGGACCGTGCCGCTTAAGGCTACTAGGCATATTGGATATCGCTATCCATTTATACTGGTTCCCTTAGATTGCTTCGTTCCATTTCTACTAGTTCTCGTAGTCTCTGTTGCATTTCCACTAGCCCTCATGAACTCGTTCCATCTCTGCTAGTCCTAATGGACTTTGTCGTCCAAGGCTACTAGTCTTGTTGGATAGGCCATCCATTCGACTAGTCTCCATTGGGTTGCTTAGTTCATTTCTACTAGTCCTCTTGTACTTGAACCCACTTCAACTAGTCCTTATAGGCTTAGGACCATCTCCACTAGTTCCAGTGGACTTTGTCGTTCAAGGCTACCGGTTT-3′。2.鉴别长梗黄精和多花黄精的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物CG_Fb：5′-GACTGCGTACGAATTGTCGAT-3′，下游引物CG_Rb：5′-AAACCGGTAGCCTTGAACG-3′。3.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对长梗黄精和多花黄精进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测黄精样本的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋其岩，李海波，叶碧欢，廖荣俊，翁永发，李楠，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，衢州市林业技术推广站，
类型：发明
国别省市：浙江,33