一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，包括提取覆盆子及其多种混淆品DNA、选取PCR扩增引物核苷酸序列、PCR扩增、PCR扩增产物质量检查，用限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应后进行琼脂糖凝胶电泳分析，即可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品。其优点为准确性高，稳定性好，通用性高，成本低，步骤简单快速，受药材DNA模板质量及反应条件等影响小。

A Method for Rapid Identification of Raspberry and Its Various Confusions

The invention discloses a method for quickly identifying raspberry and its various confusing products, including extracting raspberry and its various confusing products DNA, selecting PCR amplification primers nucleotide sequence, PCR amplification, PCR amplification product quality check, and using restriction endonuclease DpnII or MboI to perform agarose gel electrophoresis analysis after enzyme digestion and reaction, so that it can quickly identify and judge the authenticity of raspberry. Is there any adulterant in it? Its advantages are high accuracy, good stability, high versatility, low cost, simple and fast steps, little affected by the quality of DNA template and reaction conditions of medicinal materials.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法
本专利技术属于分子生药学
，尤其涉及一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法。
技术介绍
覆盆子是蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子RubuschingiiHu（又名掌叶覆盆子）的干燥未成熟果实。具有益肾固精缩尿，养肝明目的功效，临床上用于治疗遗精滑精，遗尿尿频，阳痿早泄，目暗昏花，是一味较常用的中药。华东覆盆子与多种近缘属植物（如：茅莓、寒莓、插田泡和蓬蘽等）的地上部分，尤其是果实形态非常接近，极易混淆，在生产和临床应用中误采误用或掺杂混用等现象时有发生，为确保临床用药安全有效，对覆盆子药材基原植物的鉴定非常重要。目前关于覆盆子与绵果悬钩子、山莓、蓬蘽等混淆品的鉴别方法已有研究报道，大都基于外部性状、显微特征、理化鉴别等传统方法，外部形态和显微结构主观性强，需需要丰富的形态学鉴定实践经验的积累，一般人难掌握，且经过产地粗加工和饮片炮制后，难以看出其本身的形状和颜色，显微特征也有不同程度的破坏，造成鉴定困难。理化方法用于覆盆子与混淆品的鉴别，目前尚没有专属性的通用鉴别方法，且药材的化学成分受生长周期、贮存条件、炮制方法和生长环境等多方面因素影响会有明显变化，鉴别指标难以标准化，对鉴别结果的准确性也存在较大的影响。且目前尚没有可同时区分多种混淆品的方法。中药材种质分子鉴定技术直接利用DNA序列进行物种的鉴定，不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，具有独一无二的准确性和可重复性，且经优化后实验过程标准化，操作简单快速，近年来已逐渐成功应用于某些药材的鉴别，由于不同生物体遗传变异发生在不同的DNA序列中，尤其是对于植物，其基因组进化速率慢，变异度不够，不同植物类群中用于鉴别PCR扩增的目标序列存在较大的差异，ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS等都有作为候选序列的报道。目前还未获得广泛通用的植物DNA条形码标准片段，因此，对于不同植物基原的鉴别效果均需要建立在大量的实验评价筛选基础上。吕群丹等探索了ITS2条形码序列分析在搁公扭根（掌叶覆盆子根）及其9种同属易混种的分子鉴别中的应用，通过样品的DNA扩增、测序，计算遗传距离，并采用NJ进化树进行聚类分析等步骤，结果表明，搁公扭根各单倍型序列单独聚为一支，且与山莓和武夷悬钩子位于同一大分支中，可见，对ITS2测序可用于鉴别搁公扭根及其同属易混种。然而该方法首先需要提取DNA，对PCR扩增产物测序和聚类软件分析比对才能判断该植物的种类，需要具备的专业学术知识要求高，且操作步骤中需要DNA测序，成本高，耗时长，不适合快速鉴定。因此本领域特别需要建立一种能在生产实践中推广应用的覆盆子及其多种混淆品的鉴别方法。本专利技术提供的方法能实现覆盆子及其多种混淆品的快速、便捷、直观的鉴别，提高鉴别结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：提供了一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，包括以下步骤：步骤一：提取覆盆子及其多种混淆品的DNA；步骤二：PCR扩增：首先选取上游引物核苷酸序列5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’和下游引物核苷酸序列5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；然后在PCR管中制备25微升反应体系：加入10×PCR缓冲液，25毫摩尔/升镁离子，10毫摩尔/升dNTP，5单位/微升Taq酶，20微摩尔/升引物，模板DNA和双蒸水进行充分混匀，而后在90~95℃预变性2~5分钟后变性20~40秒，53~55℃退火20~40秒，70~75℃延伸20~40秒，20~30个循环，最后70~75℃延伸3~5分钟，得到的PCR扩增的基因片段大小为650~800bp，再对反应后的PCR扩增产物进行质量检查；步骤三：用PCR产物进行DNA测序，采用双向测序测定核苷酸序列，先后用不同引物测定覆盆子及其多种混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS多个DNA序列，经序列分析，覆盆子样品序列具有限制性内切酶DpnII或MboI的识别位点，识别序列为/gatc；步骤四：在灭菌离心管中加入PCR产物，10×缓冲液，灭菌超纯水，限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应，反应温度为30~40℃，反应时间为15~20分钟；步骤五：取适量的酶切反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，在电压为110~130V下，电泳35~45分钟，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，若样品出现165~175bp+530~560bp二条带，则供试样品为覆盆子，若不具有二条带或条带分子量，则供试品非覆盆子来源或混杂有其他混淆品，从而可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品；此后，鉴别覆盆子及其多种混淆品只需重复步骤一、二、四、五。PCR扩增产物质量检查：取DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，在110~130V电压下电泳，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，在紫外凝胶成像系统下检测DNA条带。PCR扩增的基因片段优选的为700~750bp。10×缓冲液的组成为：10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸，100毫摩尔/升氯化钾，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，0.2毫克/毫升牛血清白蛋白，50%甘油。覆盆子出现的二条带其中优选的为171bp+545bp。提供了另一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，包括以下步骤一：提取覆盆子及其多种混淆品的DNA；步骤二：PCR扩增：首先选取上游引物核苷酸序列5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’和下游引物核苷酸序列5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；然后在PCR管中制备25微升反应体系：加入10×PCR缓冲液，25毫摩尔/升镁离子，10毫摩尔/升dNTP，5单位/微升Taq酶，20微摩尔/升引物制备预混液最后加入模板DNA和双蒸水进行充分混匀，而后在90~95℃变性20~40秒，53~55℃退火20~40秒，70~75℃延伸20~40秒，20~30个循环，最后70~75℃延伸3~5分钟，得到的PCR扩增的基因片段大小为650~800bp，再对反应后的PCR扩增产物进行质量检查；步骤三：用PCR产物进行DNA测序，采用双向测序测定核苷酸序列，先后用不同引物测定覆盆子及其多种混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS多个DNA序列，经序列分析，覆盆子样品序列具有限制性内切酶DpnII或MboI的识别位点，识别序列为/gatc；步骤四：在灭菌离心管中加入PCR产物，10×缓冲液，灭菌超纯水，限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应，反应温度为30~40℃，反应时间为15~20分钟；步骤五：取适量的酶切反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，在电压为110~130V下，电泳35~45分钟，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，若样品出现165~175bp+530~560bp二条带，则供试样品为覆盆子，若不具有二条带或条带分子量，则供试品非覆盆子来源或混杂有其他混淆品，从而可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：提取覆盆子及其多种混淆品的DNA；步骤二：PCR扩增：首先选取上游引物核苷酸序列5’‑CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG‑3’和下游引物核苷酸序列5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’；然后在PCR管中制备25微升反应体系：加入10×PCR缓冲液，25毫摩尔/升镁离子，10毫摩尔/升dNTP，5单位/微升Taq酶，20微摩尔/升引物，模板DNA和双蒸水混匀，而后在90～95℃预变性2～5分钟后变性20～40秒，53～55℃退火20～40秒，70～75℃延伸20～40秒，20～30个循环，最后70～75℃延伸3～5分钟，得到的PCR扩增的基因片段大小为650～800bp，再对反应后的PCR扩增产物进行质量检查；步骤三：用PCR产物进行DNA测序，采用双向测序测定核苷酸序列，先后用不同引物测定覆盆子及其多种混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA‑trnH、rpoC1、rpoB、psbK‑psbI、ITS多个DNA序列，经序列分析，覆盆子样品序列具有限制性内切酶DpnII或MboI的识别位点，识别序列为/gatc；步骤四：在灭菌离心管中加入PCR产物，10×缓冲液，灭菌超纯水，限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应，反应温度为30～40℃，反应时间为15～20分钟；步骤五：取适量的酶切反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，在电压为110～130V下，电泳35～45分钟，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，若样品出现165～175bp+530～560bp二条带，则供试样品为覆盆子，若不具有二条带或条带分子量，则供试品非覆盆子来源或混杂有其他混淆品，从而可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品；此后，鉴别覆盆子及其多种混淆品只需重复步骤一、二、四、五。...

【技术特征摘要】
2018.12.29 CN 20181164110791.一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：提取覆盆子及其多种混淆品的DNA；步骤二：PCR扩增：首先选取上游引物核苷酸序列5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’和下游引物核苷酸序列5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；然后在PCR管中制备25微升反应体系：加入10×PCR缓冲液，25毫摩尔/升镁离子，10毫摩尔/升dNTP，5单位/微升Taq酶，20微摩尔/升引物，模板DNA和双蒸水混匀，而后在90～95℃预变性2～5分钟后变性20～40秒，53～55℃退火20～40秒，70～75℃延伸20～40秒，20～30个循环，最后70～75℃延伸3～5分钟，得到的PCR扩增的基因片段大小为650～800bp，再对反应后的PCR扩增产物进行质量检查；步骤三：用PCR产物进行DNA测序，采用双向测序测定核苷酸序列，先后用不同引物测定覆盆子及其多种混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS多个DNA序列，经序列分析，覆盆子样品序列具有限制性内切酶DpnII或MboI的识别位点，识别序列为/gatc；步骤四：在灭菌离心管中加入PCR产物，10×缓冲液，灭菌超纯水，限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应，反应温度为30～40℃，反应时间为15～20分钟；步骤五：取适量的酶切反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，在电压为110～130V下，电泳35～45分钟，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，若样品出现165～175bp+530～560bp二条带，则供试样品为覆盆子，若不具有二条带或条带分子量，则供试品非覆盆子来源或混杂有其他混淆品，从而可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品；此后，鉴别覆盆子及其多种混淆品只需重复步骤一、二、四、五。2.如权利要求1所述的一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，所述的PCR扩增产物质量检查：取DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，在110～130V电压下电泳，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，在紫外凝胶成像系统下检测DNA条带。3.如权利要求1所述的一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的基因片段优选的为700～750bp。4.如权利要求1所述的一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，所述的10×缓冲液的组成为：10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸，100毫摩尔/升氯化钾，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，0.2毫克/毫升牛血清白蛋白，50％甘油。5.如权利要求1所述的一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，所述的覆盆子出...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭昕，袁莉霞，陈宏降，王志安，
申请(专利权)人：浙江医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：浙江,33