一种诱导型启动子及其用途制造技术

本发明专利技术针对目前工业上甾体生物转化羟化反应转化效率偏低的问题，提供一种诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该启动子能够诱导P450羟化酶基因(PRH)的表达，为构建高效催化甾体化合物羟化反应的基因工程菌株奠定坚实的基础，对于提高甾体化合物的生物转化效率具有重要的意义。

An Inducible Promoter and Its Application

The present invention provides an inducible promoter whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO:1 to solve the problem of low conversion efficiency of steroid biotransformation hydroxylation reaction in industry. The promoter can induce the expression of P450 hydroxylase gene (PRH), lay a solid foundation for the construction of genetically engineered strains which can catalyze the hydroxylation of steroids efficiently, and is of great significance for improving the efficiency of steroid biotransformation.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导型启动子及其用途
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种诱导型启动子及其用途。
技术介绍
甾体激素类药物是目前仅次于抗生素的第二大类药物，在临床上具有极其重要的医药价值，在维持生命、调节生理功能、免疫功能、机体生长、皮肤病治疗及生育控制等方面具有良好的作用。化学合成在甾体化合物的研究和生产过程中仍具有举足轻重的地位，而在甾体激素药物的生产中，微生物转化技术已成为许多甾体化合物或其中间体合成路线中不可缺少的关键技术。大量事实表明，甾体化合物工业是将化学合成技术和生物技术相结合应用于工业生产的一个典范。微生物对甾体化合物的转化反应多种多样，比较典型的微生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链降解等。其中，甾体化合物生物催化羟基化尤为重要。目前，甾体化合物的生物催化羟基化因其高效性，已广泛应用到抗炎药、免疫抑制剂、促孕剂、利尿剂、同化剂以及避孕药的生产中。细菌和真菌都可以催化甾体的羟基化反应，但目前成功应用于工业生产的大多为丝状真菌如曲霉和青霉等。在甾体化合物生物催化过程中，菌体自身的催化活性直接影响产物的转化效率。随着分子生物学的发展，构建具有高转化能力的基因工程菌株以提高甾体转化效率成为近年来的研究热点。丝状真菌中催化羟基化反应的羟基化酶属于P450酶系，但目前对于参与反应的羟化酶研究相对较少，国内外相关羟化酶启动子也未见报道，其表达调控机制更不明确。采用雷斯青霉催化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮的C15α位羟基化反应，合成孕二烯酮的重要中间体—15α-羟基左旋乙基甾烯双酮(如图1)。与化学合成方法相比，其反应条件较温和，产物较单一，具有很高的区域选择性，立体选择性和化学选择性，易于纯化，且转化率高，生产成本低，对环境友好。研究证明，Penicilliumraistrickii(ATCC10490)是羟化效果最佳的菌株。已有的研究证实丝状真菌的甾体C15α-羟化酶在转录水平上受甾体底物诱导(JiaLonggang,DongJianzhang,Wangruijie,etal.Identificationandcharacterizationofthesteroid15α-hydroxylasegenefromPenicilliumraistrickii,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2017,101(16):6409～6418)，但有关羟化酶的诱导机制及其相关基因尚未见文献报道。因此，对于来源于P450羟化酶基因启动子的研究，将为阐述羟化酶的生物催化反应分子机制奠定良好基础，同时也为构建下一代高效工程菌提供了关键的基因资源，对于甾体药物生物催化羟基化的高效生产具有重要的意义。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对目前工业上甾体生物转化羟化反应转化效率偏低的问题，提供一种诱导型启动子p800，该启动子能够诱导P450羟化酶基因(PRH)的表达，为构建高效催化甾体化合物羟化反应的基因工程菌株奠定坚实的基础，对于提高甾体化合物的生物转化效率具有重要的意义。本专利技术所述诱导型启动子p800的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术所述诱导型启动子p800来源于雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC10490。本专利技术所述诱导型启动子p800也可以是能与SEQIDNO：1所示序列杂交并且具有启动子功能的核苷酸序列。含有本专利技术所述诱导型启动子p800的表达盒、表达载体、重组载体或宿主细胞也属于本专利技术的保护范围。基因扩增含有本专利技术所述诱导型启动子p800DNA全长或部分片段的引物序列也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述诱导型启动子p800，可用于甾体化合物羟化酶基因的诱导表达。本专利技术所述诱导型启动子p800，可用于丝状真菌中甾体化合物羟化酶基因的诱导表达。本专利技术所述的诱导型启动子p800，可用于包括但不限于甾体15α-羟化酶、11α-羟化酶、16α-羟化酶、7α-羟化酶、14α-羟化酶、9α-羟化酶或11β-羟化酶基因的诱导表达。所述基因表达的羟化酶可以催化包括但不限于甾体化合物C15α、C11α、C16α、C7α、C14α、C9α或C11β的羟基化反应。本专利技术所述的诱导型启动子p800，可用于构建诱导表达羟化酶的基因工程重组菌。所述基因工程重组菌可以是丝状真菌。有益效果：本专利技术实例考察了增加雷斯青霉ATCC10490C15α-羟化酶基因PRH的拷贝数对转化左旋乙基甾烯双酮效率的影响。通过构建PRH诱导型表达载体，并运用同源重组的方法获得了相应含两个拷贝PRH基因的重组菌株。甾体转化实验表明雷斯青霉重组菌株的转化率显著高于现有生产菌种，同时极大缩短了转化时间，本专利技术的研究成果具有重要的商业应用价值。附图说明：图1：左旋乙基甾烯双酮的15α羟基化生物催化反应。图2：启动子p800产物验证电泳图；M：Marker；p800：启动子p800。图3A：诱导型启动子表达载体pPZP-L-HYG-p800-PRH-TT-R的构建示意图。图3B：重组表达载体pPZP-L-HYG-p800-PRH-TT-R酶切验证图；M：10kbDNAladder；1：酶切产物。图4：农杆菌AGL-1pPZP-L-HYG-p800-PRH-TT-R转化子菌落PCR验证电泳图；M：10kbDNAladder，w：农杆菌AGL-1野生型，1-10：电转农杆菌转化子。图5：15α-羟化酶PRH基因表达盒定点整合和基因重组菌验证；M：10kbDNAladder；1、2：过表达菌株(p800)转化子。图6：雷斯青霉重组菌与野生型菌株的PRH基因拷贝数比较。图7：不同发酵时间段雷斯青霉菌株的底物转化率。图8A：诱导型启动子表达载体pPZP-L-HYG-p800-AOH-TT-R的构建示意图。图8B：重组表达载体pPZP-L-HYG-p800-AOH-TT-R酶切验证图；M：10kbDNAladder；2：酶切产物。具体实施方式：以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。涉及菌株：雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC10490，赭曲霉(Aspergillusochraceus)TCCC41060，根癌农杆菌AGL-1(也可以使用根癌农杆菌LBA4404实现介导，具有同样效果)，天津科技大学微生物菌种保藏中心。所用的酶及试剂：限制性内切酶EcoRI、NotI、SacI、HindIII、KpnI、SolutionI连接试剂盒及PyrobestDNA聚合酶购买自Takara公司。甲醇、乙腈、乙酸乙酯及石油醚购买自天津化学试剂六厂。其他常规试剂为进口分装或国产分析纯。引物的合成及序列的测定由北京华大公司完成。所用培养基：PDA培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，115℃灭菌15min。LB培养基(g/L)：蛋白胨10，NaCl10，酵母粉5，121℃灭菌20min。YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，115℃灭菌20min。20×ABSalt：MgSO4·7H2O6g，NH4Cl20g，CaCl20.2g，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导型启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或是与SEQ ID NO：1所示序列杂交并且具有启动子功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种诱导型启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，或是与SEQIDNO：1所示序列杂交并且具有启动子功能的核苷酸序列。2.包含权利要求1所述诱导型启动子的基因表达盒、重组载体、表达载体或宿主细胞。3.如权利要求2所述的重组载体或表达载体，其特征在于，所述重组载体为pBlue-HYG，所述表达载体为pPZP-HYG。4.如权利要求2所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为丝状真菌。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述丝状真菌为雷斯青霉或赭曲霉。6.扩增权利要求1所述诱导型启动子DNA全长的引物对，其特征在于，所述引物对序列如下：5’-CTAGACTACGTAGTATCTTGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛淑红，刘晓光，王正祥，路福平，王雪，贾龙刚，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12