一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成制造技术

本发明专利技术公开了一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成，它包括以下步骤：步骤一，RNase P在EGS引导下对流行性感冒病毒基因mRNA进行切割的靶序列区域的确定；步骤二，EGS的设计:EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成；步骤三，EGS的人工合成：将设计好的EGS序列进行合成，备用；步骤四，合成的结果：根据序列通式5'‑U/CGNNNNNNU‑3'，在流感病毒八个基因片段中搜寻到100个左右潜在切点。本发明专利技术对某些基团进行化学修饰以提高其稳定性和导入效率，极大地提高EGS基因药物的效率，强化抗流感的广谱性。

Synthesis of an Anti-influenza Virus EGS Nucleic Acid Drug

The invention discloses the synthesis of an anti-influenza virus EGS nucleic acid drug, which includes the following steps: step 1, RNase P determines the target sequence region of influenza virus gene RNA cutting under the guidance of EGS; step 2, the design of EGS: the structure of EGS is usually composed of three parts: the sequence of 5'binding region, the sequence of T stem ring and additional ring region of tRNA and the sequence of 3' binding region. Composition; Step 3, Artificial synthesis of EGS: The designed EGS sequence was synthesized and standby; Step 4, the results of synthesis: According to the general formula of 5'U / CGNNNNNNNNNU 3', about 100 potential cut points were found in eight gene fragments of influenza virus. The invention chemically modifies some groups to improve their stability and introduction efficiency, greatly improves the efficiency of EGS gene drugs, and strengthens the broad spectrum of anti-influenza.

【技术实现步骤摘要】
一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成
本专利技术涉及一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成。
技术介绍
流行性感冒病毒(Influenzavirus)是流行性感冒（简称流感）的病原体。长期以来，流感一直是危害人类健康和公众安全的严重传染病，每年由此造成的经济损失也十分巨大。流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属的单股RNA病毒。典型的病毒粒子呈球形，有囊膜，直径为80~120纳米，个别有长短不齐的丝状粒子，囊膜表面覆盖有紧密排列的纤突，分别为病毒的血凝素和神经氨酸酶蛋白。根据NP蛋白性的不同，可将流感病毒分为A,B,C三型。根据HA和NA抗原性的差异，可分为不同亚型，迄今已发现16种HA（H1~H16）,10种NA（N1~N10）,任一种HA与任一种NA结合后即为一种血清亚型。在自然界，流感病毒在人以及猪和马等动物，尤其是鸟类中间持续流行。流感病毒基因组为分节段、单股负链RNA，共有8个独立的RNA片段。分别编码聚合酶PB1、PB2、PA、血凝素(HA)、核衣壳蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白Ml和M2、非结构蛋白NS1和NS2。流感病毒的聚合酶(Polymerase)由PB2、PB1和PA组成，由病毒RNA片段(1-3)编码，其分子量依次为87KD.96KD.85KD。PB2，在病毒mRNA转录的起始阶段识别并结合在6’端I型帽状结构上，另外它还有限制性内切酶的活性，参与宿主mRNA帽状结构的切割。PB1，在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长。PA，在病毒RNA转录和复制过程中与PB1、PB2一起随链的延长而移动，主要参与病毒RNA的复制，与PB1、PB2共同构成RNA聚合酶复合体。在病毒RNA的合成过程中起蛋白激酶或解旋酶的作用。血凝素(Hemagglutinin,HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，由片段4编码。是结合宿主唾液酸之类的细胞受体，使病毒附着于细胞上，帮助病毒穿透宿主的细胞膜并改变抗原性，以逃脱宿主免疫系统的监视。核蛋白(Nucleoprotein,NP)由片段5编码的结构蛋白.分子量为60KD，它是病毒核衣壳的主要蛋白成分。具有型特异性。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)也构成病毒囊膜的纤突，呈簇存在。NA是一种唾液酸酶，可以识别细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基，使病毒能够进入细胞,NA的另一个功能是为要出芽的病毒粒子清理通道，防止病毒粒子聚集，有利于病毒粒子的成熟和释放。基质蛋白(Matrixproteins,M)有两种基质蛋白Ml、M2。M1由252个氨基酸残基组成，分子量约为26KD,是所有蛋白成分中含量最多的一种，构成病毒的基质膜，具有型特异性。M2由97个氨基酸残基组成，分子量约为15KD。是一种跨膜蛋白，以四聚体的形式存在于感染细胞的细胞膜上。非结构蛋白(NonstructuralProteins,NS)有种非结构蛋白即NS1和NS2，分子量分别为25KD和12KD，NSl在感染的早期合成，NS2在感染的后期合成。NS1蛋白为结合蛋白，它具有抑制带poly(A)结构的mRNA从细胞核内向外运输的功能。NS2又叫核转出蛋白(NEP)，是磷酸化蛋白直接参与子代病毒RNP从病毒细胞中释放出来的过程。目前抗流感病毒化学药物存在的主要问题包括耐药性、毒副作用和烷胺类药物对B型流感无作用三方面。目前国内主要利用RNA干扰技术研制开发抗流感病毒核酸药物。四川大学杨晓芳、赵培等人研究siRNA重组质粒抗甲型流感病毒的作用，进一步证实了RNA干扰对流感病毒复制的抑制作用，江西医学院刘菲菲等人研究了抗流感病毒药物与细胞凋亡，发现抗流感病毒药物除了金刚烷类药物外，还有流感病毒受阻断药物、黑色素等。中国人民解放军军事医学科学院的王升启等人专利技术了一种靶向凋亡诱导因子的抗流感病毒反意义核苷酸，发现该药物能有效地抑制H1N1、H3N2、H5N1型流感病毒所致的细胞病变，中国疾病预防控制中心高永珍等人专利技术了一种针对乙型流感病毒核壳蛋白基因的siRNA序列，可有效抑制乙型流感病毒在细胞和动物模型的复制与感染。综上所述，国内已见多种以RNA干扰为理论基础的抗流感病毒药物的报道，但未见以EGS-RNA技术为理论基础，具有高效性、广谱性等特点的抗流感病毒核酸药物研制的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成，它在分析流感病毒PB1基因序列基础上设计出EGS，体外化学合成EGS,并对某些基团进行化学修饰以提高其稳定性和导入效率，极大地提高EGS基因药物的效率，强化抗流感的广谱性。本专利技术采用了以下技术方案：一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成，它包括以下步骤：步骤一，RNaseP在EGS引导下对流行性感冒病毒基因mRNA进行切割的靶序列区域的确定：确定靶RNA中潜在切点，靶RNA的高效切割位点具备以下特征，即切点的-1和+1位应分别为嘧啶(U/C)和鸟嘌呤(G)，切点的+8位最好应为尿嘧啶(U)，因此，根据序列通式5’-U/CGNNNNNNＵ-3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点；步骤二，EGS的设计:EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成，其中，T茎环与额外环区序列是固定的，全部EGS的该部分序列均选自于人tRNA，5’结合区和3’结合区序列在不同EGS则不相同，在GeneBank中寻找A型流感病毒临床毒株靶序列PA,PB1和M1基因的保守序列，在潜在切点已确定的情况下，根据该切点附近的序列，按照碱基互补配对的原则，设计针对该切点的EGS结合区序列，在设计时应注意，切点的-1位不能与EGS的碱基配对：靶RNA与EGS两侧结合区互补的序列之间应间隔2nt；EGS结合区序列至少具备12nt以尽量保证互补结合的特异性，所设计的全部EGS，如EGSE-PA,E-PB1和E-M1的结合区序列长度为14－16nt，5’结合区和3’结合区序列的长度各为7-9nt；步骤三，EGS的人工合成：将设计好的EGS序列进行合成，合成时添加2’-O-methyl化学修饰，同时还合成了针对所设计的EGS的相应对照EGS(ControlEGS，C-EGS)作为对照试验，以无菌三蒸水将EGS冻干物溶解，并稀释至100uM，分装保存于-20℃、-80℃，备用；步骤四，合成的结果：根据序列通式5'-U/CGNNNNNNU-3'，在流感病毒八个基因片段中搜寻到100个左右潜在切点，此外，EGS中的T环中存在三个碱基的保守基序“TTC"，如果改变保守基序，其引导切割活性将大大降低，在正常EGS的基础上，分别将各EGS中的T环保守基序“TTC”全部变成“AAG"，以作为相应EGS的对照EGS(controlEGS，C-EGS)。经过体外切割实验筛选到3个具有明显切割活性的EGS,分别命名为E-PA,E-PB1,E-M1,它们分别位于PA,PB1,M1基因的15,1224,222位，根据这三个位点处附近的序列，设计相应的EGS，本专利技术步骤四中EGS的序列为：编号EGS名称EGS序列1E-PA5-GGUUAACAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCUUGUCGCAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成，其特征是它包括以下步骤：步骤一， RNase P在EGS引导下对流行性感冒病毒基因mRNA进行切割的靶序列区域的确定：确定靶RNA中潜在切点，靶RNA的高效切割位点具备以下特征，即切点的‑1和+1位应分别为嘧啶(U/C)和鸟嘌呤(G)，切点的+8位最好应为尿嘧啶(U)，因此，根据序列通式5’‑U/CGNNNNNNＵ‑3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点；步骤二，EGS的设计:EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成，其中，T茎环与额外环区序列是固定的，全部EGS的该部分序列均选自于人tRNA，5’结合区和3’结合区序列在不同EGS则不相同，在GeneBank中寻找A型流感病毒临床毒株靶序列PA, PB1和M1基因的保守序列，在潜在切点已确定的情况下，根据该切点附近的序列，按照碱基互补配对的原则，设计针对该切点的EGS结合区序列，在设计时应注意，切点的‑1位不能与EGS的碱基配对：靶RNA与EGS两侧结合区互补的序列之间应间隔2nt；EGS结合区序列至少具备12nt以尽量保证互补结合的特异性，所设计的全部EGS ，如EGS E‑PA, E‑PB1和E‑M1的结合区序列长度为14－16nt ，5’结合区和3’结合区序列的长度各为7‑9 nt；步骤三，EGS的人工合成：将设计好的EGS序列进行合成，合成时添加2’‑O‑methyl化学修饰，同时还合成了针对所设计的EGS的相应对照EGS (Control EGS，C‑EGS )作为对照试验，以无菌三蒸水将EGS冻干物溶解，并稀释至100uM，分装保存于‑20℃、‑80℃，备用；步骤四，合成的结果：根据序列通式5'‑U/CGNNNNNNU‑3'，在流感病毒八个基因片段中搜寻到100个左右潜在切点，此外， EGS中的T环中存在三个碱基的保守基序“TTC"，如果改变保守基序，其引导切割活性将大大降低，在正常EGS的基础上，分别将各EGS中的T环保守基序“TTC”全部变成“AAG"，以作为相应EGS的对照EGS (controlEGS，C‑EGS)，经过体外切割实验筛选到3个具有明显切割活性的EGS,分别命名为E‑PA,E‑PB1,E‑M1,它们分别位于PA,PB1,M1基因的15, 1224, 222位，根据这三个位点处附近的序列，设计相应的EGS。...

【技术特征摘要】
1.一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的合成，其特征是它包括以下步骤：步骤一，RNaseP在EGS引导下对流行性感冒病毒基因mRNA进行切割的靶序列区域的确定：确定靶RNA中潜在切点，靶RNA的高效切割位点具备以下特征，即切点的-1和+1位应分别为嘧啶(U/C)和鸟嘌呤(G)，切点的+8位最好应为尿嘧啶(U)，因此，根据序列通式5’-U/CGNNNNNNＵ-3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点；步骤二，EGS的设计:EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成，其中，T茎环与额外环区序列是固定的，全部EGS的该部分序列均选自于人tRNA，5’结合区和3’结合区序列在不同EGS则不相同，在GeneBank中寻找A型流感病毒临床毒株靶序列PA,PB1和M1基因的保守序列，在潜在切点已确定的情况下，根据该切点附近的序列，按照碱基互补配对的原则，设计针对该切点的EGS结合区序列，在设计时应注意，切点的-1位不能与EGS的碱基配对：靶RNA与EGS两侧结合区互补的序列之间应间隔2nt；EGS结合区序列至少具备12nt以尽量保证互补结合的特异性，所设计的全部EGS，如EGSE-PA,E-PB1和E-M1的结合区序列长度为14－16nt，5’结合区和3’结合区序列的长度各为7-9nt；步骤三，EGS的人工合成：将设计好的EGS序列进行合成，合成时添加2’-O-methyl化学修饰，同时还合成了针对所设计的EGS的相应对照EGS(ControlEGS，C-EGS)作为对照试验，以无菌三蒸水将EGS冻干物溶解，并稀释至100uM，分装保存于-20℃、-80℃，备用；步骤四，合成的结果：根据序列通式5'-U/CGNNNNNNU-3'，在流感病毒八个基因片段中搜寻到100个左右潜在切点，此外，EGS中的T环中存在三个碱基的保守基序“TTC"，如果改变保守基序，其引导切割活性将大大降低，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨竹，
申请(专利权)人：泰州市病毒研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32