本发明专利技术公开一种检测人明胶酶MMP‑2的荧光多肽底物。所述荧光多肽底物包括如PeptideⅡ所示的氨基酸序列，并且在氨基酸序列第1位的缬氨酸结合荧光基团5‑羧基荧光素，第11位的赖氨酸结合荧光猝灭基团5‑羧基四甲基若丹明。本发明专利技术所述的荧光多肽底物与人MMP‑2反应，其酶促反应动力学常数Km为315μM，Kcat/Km：2565M
A Fluorescent Polypeptide Substrate for Detection of Human Gelatinase MMP-2 and Its Application
The invention discloses a fluorescent polypeptide substrate for detecting human gelatinase MMP_2. The fluorescent polypeptide substrate comprises an amino acid sequence as shown in Peptide II, and valine at the first position of the amino acid sequence binds fluorescent group 5 -carboxyfluorescein, and lysine at the eleventh position binds fluorescence quenching group 5 -carboxytetramethyl rhodamine. The fluorescent polypeptide substrate of the invention reacts with human MMP_2, and its enzymatic reaction kinetics constant Km is 315 ugM and Kcat/Km:2565M.
【技术实现步骤摘要】
一种检测人明胶酶MMP-2的荧光多肽底物及其应用
本专利技术涉及一种含有特定序列或基序的可检测人明胶酶-2(MMP-2)的荧光多肽底物及其活性检测方法，属于生物
技术背景基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinases，MMPs)几乎可降解细胞外基质各种蛋白成分，是一类依赖Zn2+内肽酶家族，主要来源于如脑组织，内皮细胞，成纤维细胞及平滑肌细胞等多种组织及细胞[1]。据底物特异性，序列相似性以及结构域组成可将MMPs分为明胶酶(MMP-2、MMP-9)，胶原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)，间质溶解酶(MMP-3、MMP-10、MMP-11)，基质溶解因子(MMP-7、MMP-26)，膜型基质金属蛋白酶(MT-MMPs；(MMP-14、MMP-15等)及其他分泌型MMPs(MMP-19、MMP-21等)六大类[2]。MMPs不仅参与组织重塑、血管生成、伤口愈合以及胚胎生成和发育等生理过程，而且在诸如高血压、先兆子痫、急性心肌梗死、动脉瘤形成、静脉扩张、恶性肿瘤等疾病的病理生理过程中也起到关键性作用[3,4]。通过检测基质金属蛋白酶，可深度了解疾病的致病机理，有助于疾病的早期诊治，因此关于基质金属蛋白酶检测技术的研究开发至关重要。明胶酶，包括MMP-2及MMP-9，主要降解明胶(变性胶原)以及Ⅳ型胶原，且可裂解MMPs前体使其活化，还可降解调节动脉粥样硬化炎症反应的生物活性因子，如：生长因子、细胞因子、肿瘤坏死因子-β1等。大量研究表明，MMP-2及MMP-9参与胚胎着床、血管平滑肌细胞增殖、细胞外基质降解以及血栓性疾病、心力衰竭、恶性肿瘤等生理病理过程[4-15]。但是，尽管二者结构相似，其参与某些疾病的病理生理条件却不完全相同。例如，在心力衰竭中，与MMP-9相比，MMP-2似乎更依赖于神经体液调节，而MMP-9与缺血性心力衰竭的病因和心肌缺血过程密切相关，且其在心肌梗死后心肌重塑过程中发挥着选择性抑制的作用[16,17]。通过判别分析，循环中MMP-2可作为预测新发心力衰竭患者心衰前期的心血管事件的生物标志物，具有较高的预后价值；而多项研究明确证实了循环中MMP-9对于心肌梗死后心衰的进展或心血管死亡事件的预后作用[18-21]。因此，对MMP-2及MMP-9致病机理的深入研究有望实现对相关疾病的有效诊治。目前常见的MMPs酶活性检测方法主要有：荧光探针技术、高效液相色谱法、同位素测定法、分光光度法、电化学法等方法检测蛋白酶活性。由于荧光探针技术可实现“实时、定量、可视化”潜力，且灵敏度一般比其他几类高若干个数量级，同时荧光多肽的合成及纯化方法简便，可避免温度、离子强度及pH等对实验结果的影响，已被普遍用于生物结构研究、化学分析等领域，特别是在蛋白酶学相关研究中效果显著。荧光底物检测MMPs活性的基本原理：在荧光共振能量转移(FRET)肽两端分别结合荧光基团和淬灭剂，在完整的FRET肽中，荧光基团被淬灭剂淬灭，无法在荧光基团激发波长内检测到能量；通过MMPs切割成两个独立片段后，荧光基团荧光恢复，并且可以在特定激发/发射(Ex/Em)波长下监测荧光强度，从而达到检测蛋白酶活性的目的[22]。然而，MMPs家族间存在底物相似性。建立一个敏感且特异性高，即可以检测MMP-2活性，又可以区分同属于明胶酶的MMP-2及MMP-9的底物及检测方法，对开展明胶酶的功能研究至关重要。参考文献：[1]GalisZS,KhatriJJ.Matrixmetalloproteinasesinvascularremodelingandatherogenesis:thegood,thebad,andtheugly[J].Circulationresearch.2002,90(3):251-62.[2]VisseR,NagaseH.Matrixmetalloproteinasesandtissueinhibitorsofmetalloproteinases:structure,function,andbiochemistry[J].Circulationresearch.2003,92(8):827-39.[3]DabekJ,KulachA,GasiorZ.Theroleofmatrixmetalloproteinasesinacutecoronarysyndromes[J].Europeanjournalofinternalmedicine.2007,18(6):463-6.[4]WangX,KhalilRA.MatrixMetalloproteinases,VascularRemodeling,andVascularDisease[J].Advancesinpharmacology(SanDiego,Calif).2018,81:241-330.[5]BergersG,BrekkenR,McMahonG,VuTH,ItohT,TamakiK,etal.Matrixmetalloproteinase-9triggerstheangiogenicswitchduringcarcinogenesis[J].Naturecellbiology.2000,2(10):737-44.[6]SheuBC,HsuSM,HoHN,LienHC,HuangSC,LinRH.Anovelroleofmetalloproteinaseincancer-mediatedimmunosuppression[J].Cancerresearch.2001,61(1):237-42.[7]DongZ,KumarR,YangX,FidlerIJ.Macrophage-derivedmetalloelastaseisresponsibleforthegenerationofangiostatininLewislungcarcinoma[J].Cell.1997,88(6):801-10.[8]O'ReillyMS,WiederschainD,Stetler-StevensonWG,FolkmanJ,MosesMA.Regulationofangiostatinproductionbymatrixmetalloproteinase-2inamodelofconcomitantresistance[J].TheJournalofbiologicalchemistry.1999,274(41):29568-71.[9]ShiY,SuC,HuH,YanH,LiW,ChenG,etal.SerumMMP-2asapotentialpredictivemarkerforpapillarythyroidcarcinoma[J].PloSone.2018,13(6):e0198896.[10]HannocksMJ,ZhangX,GerwienH,ChashchinaA,BurmeisterM,KorposE,etal.Thegelatinases,MMP-2andMMP-9,asfinetunersofneuroinflammatoryprocesses[J].Matrixbiology:journaloft本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测人明胶酶MMP‑2的荧光多肽底物，其特征在于：包括如PeptideⅡ所示的氨基酸序列，分子量为1906Da，且其氨基酸序列第1位的缬氨酸和第11位的赖氨酸分别结合荧光基团和荧光猝灭基团。
【技术特征摘要】
1.一种检测人明胶酶MMP-2的荧光多肽底物，其特征在于：包括如PeptideⅡ所示的氨基酸序列，分子量为1906Da，且其氨基酸序列第1位的缬氨酸和第11位的赖氨酸分别结合荧光基团和荧光猝灭基团。2.根据权利要求1所述的一种检测人明胶酶MMP-2的荧光多肽底物，其特征在于：所述结合的荧光基团和荧光猝灭基团是与第1位缬氨酸的氨基结合的荧光基团5—羧基荧光素，与第11位的赖氨酸的氨基结合的荧光猝灭基团5—羧基四甲基若丹明。3.根据权利要求1所述的一种检测人明胶酶MMP-2的荧光多肽底物，其特征在于：在PH为7.5的50mMTris，10mMCaCl2，150mMNaCl，0.05％Brij-35，温度为37℃的反应体系下，MMP-2催化荧光多肽底物反应的酶促反应动力学常数Km为315μM，Kcat/Km：2565...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟照辉，万雯，叶雨佳，
申请(专利权)人：昆明医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：云南,53
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