一种高GC含量基因的零背景克隆方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高GC含量基因的零背景克隆方法及其应用。本发明专利技术通过筛选设计引物，优化扩增体系，运用改良的Slow‑down PCR方法成功克隆出高GC含量的绵羊Kiss1基因的完整CDS区和部分5＇及3＇非翻译区序列并进行生物信息学分析。本发明专利技术提供的绵羊Kiss1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术克隆得到的绵羊Kiss1基因在研究抑制肿瘤转移和调控家畜生殖功能方面有广阔的应用前景。本发明专利技术为家畜Kisspeptin相关神经肽的研究提供了新的研究对象，本发明专利技术提供的克隆方法可以给其他高GC含量的基因克隆提供理论参考。

A Zero Background Cloning Method for Genes with High GC Content and Its Application

The invention discloses a zero background cloning method of high GC content gene and its application. By screening and designing primers, optimizing the amplification system, the complete CDS region and part of 5'and 3' untranslated region sequences of sheep Kiss1 gene with high GC content were successfully cloned and bioinformatically analyzed by using the improved Slow down PCR method. The nucleotide sequence of the sheep Kiss1 gene provided by the invention is shown in SEQ ID NO.3 and the amino acid sequence of the coding protein is shown in SEQ ID NO.4. The sheep Kiss1 gene cloned by the invention has broad application prospects in the research of inhibiting tumor metastasis and regulating reproductive function of livestock. The present invention provides a new research object for the study of Kisspeptin-related neuropeptide in livestock, and the cloning method provided by the present invention can provide theoretical reference for other gene cloning with high GC content.

【技术实现步骤摘要】
一种高GC含量基因的零背景克隆方法及其应用
本专利技术涉及动物基因工程
，具体地说，涉及一种高GC含量的绵羊Kiss1基因的克隆方法，以及该方法得到的绵羊Kiss1基因的用途。
技术介绍
Kisspeptin是2001年发现的一种肽类激素，由KiSS1基因编码，在下丘脑中大量表达，可水解产生Kisspeptin-54，Kisspeptin-14、Kisspeptin-13和Kisspeptin-10等不同长度的酰胺化短肽，C端具有精氨酸和苯丙氨酸。最初发现Kisspeptin具有抑制肿瘤转移的功能。2003年，国外的研究机构发现Kisspeptin及其受体在生殖调控中具有重大作用。Kisspeptin受体突变小鼠的表型与性腺类固醇激素分泌缺乏症很相似，突变的雌鼠没有性成熟，不能妊娠，突变的雄鼠睾丸阴茎发育不全，不能产生精子。传统观念认为下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)是调控生殖功能的关键信号。近年来，由于Kisspeptin的发现刷新了人们对调控青春期启动及生殖的神经内分泌轴的认识。Kisspeptin作为下调节丘脑-垂体-性腺轴的关键参与调控GnRH的分泌，在促进促本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高GC含量基因的零背景克隆方法，其特征在于，运用Slow‑down PCR方法，对目标基因的模板DNA或cDNA进行PCR扩增，PCR所用引物长度在20‑30bp之间，GC含量在60％‑75％之间，Tm>70℃，Tm差异<1℃。

【技术特征摘要】
1.一种高GC含量基因的零背景克隆方法，其特征在于，运用Slow-downPCR方法，对目标基因的模板DNA或cDNA进行PCR扩增，PCR所用引物长度在20-30bp之间，GC含量在60％-75％之间，Tm>70℃，Tm差异<1℃。2.如权利要求1所述的零背景克隆方法，其特征在于，所述Slow-downPCR方法的工作程序为：98℃预变性2min；98℃10s，72℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，71℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，70℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，69℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，68℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，67℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，66℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，65℃30s，72℃45s，4个循环；循环结束后72℃10min。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对扩增产物回收纯化后，连接T-Vector载体转化，所述T-Vector载体为零背景克隆载体，无需蓝白斑筛选。4.一种绵羊Kiss1基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取成年绵羊下丘脑组织的mRNA，反转录为cDNA；(2)以所得的cDNA为模板，进行Slow-downPCR扩增；PCR扩增所用的引物长度在20-30bp之间，GC含量在60％-75...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国世，李广栋，张鲁，吕东颖，姚昱君，朱天奇，姬鹏云，连正兴，韩红兵，吴英杰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11