用于宿主细胞的指导RNA表达系统技术方案

本发明专利技术涉及分子生物学和细胞生物学领域。更具体地，本发明专利技术涉及一种用于真核宿主细胞的指导RNA表达系统。

Guided RNA expression system for host cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于宿主细胞的指导RNA表达系统
本专利技术涉及分子生物学和细胞生物学领域。更具体地，本专利技术涉及一种用于宿主细胞的指导RNA表达系统。
技术介绍
RNA指导的核酸酶系统(RNA-guidednucleasesystem)中最著名的是CRISPR/Cas9系统，其是一种用于基因组编辑和基因调控的强大工具。该工具需要表达Cas9蛋白和指导RNA(gRNA或sgRNA)，所述指导RNA使Cas9能够靶向特定DNA序列。在例如真核宿主系统中，指导RNA往往从RNA聚合酶III(POLIII)启动子表达，所述RNA聚合酶III(POLIII)启动子募集用于转录的内源RNA聚合酶III，所述内源RNA聚合酶III是产生没有5'帽的指导RNA的RNA聚合酶。其他方法已经将RNA聚合酶II(POLII)启动子与核酶组合使用，以产生没有5'帽的指导RNA(未加帽的RNA)。然而，现有技术的指导RNA表达需要复杂且庞大的表达盒，并且缺乏对指导RNA的量的直接调谐。此外，可以在宿主细胞中引入体外转录的指导RNA。然而，这种引入的瞬时性限制了该方法用于基因组编辑和基因组调控的用途。因此，一直迫切需要开发用于细胞内指导RNA的改进和简化的表达系统。
技术实现思路
本专利技术提供了单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶，用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的用途，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子。本专利技术还提供了一种用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的方法，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子，并且其中所述指导RNA的转录由单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，优选由病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，更优选由T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶执行。本专利技术还提供了一种组合物，所述组合物包含所述细胞、所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到根据本专利技术的启动子。本专利技术还提供了一种可通过根据本专利技术的方法获得的细胞。本专利技术还提供了一种细胞，所述细胞包含至少所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到根据本专利技术的启动子，所述细胞优选能够产生目的化合物。本专利技术还提供了一种用于生产目的化合物的方法，所述方法包括在有助于生产所述目的化合物的条件下培养根据本专利技术的细胞，以及任选地纯化或分离所述目的化合物。附图说明图1示出了整合的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因、潮霉素B(HygB)选择标记和dCas9-Mxi1(dCas9-Mxi)表达单元的图形表示。dCas9-Mxi1由半乳糖诱导的(GAL)启动子表达。图2示出了整合的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因、潮霉素B(HygB)选择标记和dCas9-Mxi1(dCas9-Mxi)/T7-RNA聚合酶(T7-RNAP)表达单元的图谱。使用2A病毒肽(2A)来从半乳糖诱导的(GAL)启动子共表达dCas9-Mxi1和T7-RNA聚合酶。图3示出了多拷贝(2微米)载体pRN1120-AG1的载体图谱。所述载体上存在诺尔丝菌素(NatMX)和氨苄青霉素(ampR)标记。所述载体含有驱动gRNA表达的SNR52启动子(SNR52p)。示出了20个核苷酸(nt)的指导序列(基因组靶序列)和gRNA结构部件。所述指导RNA序列之后是SUP4终止子(SUP43’侧翼区)。图4示出了多拷贝(2微米)载体pAG701的载体图谱。所述载体上存在诺尔丝菌素(NatMX)和氨苄青霉素(ampR)标记。载体含有驱动gRNA表达的T7启动子。示出了20nt指导序列(基因组靶序列)和gRNA结构部件。gRNA序列之后是3’自切割(自加工)核酶(HDV)和T7终止子。图5示出了与T7产生的gRNA(乱序的(T7-乱序的)和非乱序的(T7))相比，SNR52产生的gRNA(乱序的(SNR52-乱序的)和非乱序的(SNR52-靶3))的抑制效率。示出了三次单独实验的平均值和标准偏差。图6示出了以下所有测试菌株在半乳糖诱导后的细胞密度(在600nm处测量的光密度)：SNR52产生的gRNA(乱序的(SNR52-乱序的)和非乱序的(SNR52))、T7产生的gRNA(乱序的(T7-乱序的)和非乱序的(T7))。示出了三次单独实验的平均值和标准偏差。图7示出了具有SNR52产生的靶向和乱序gRNA的菌株的细胞群。图8示出了具有T7产生的靶向和乱序gRNA的菌株的细胞群。图9示出了由不同强度的T7启动子(T7-高、T7-中、T7-低和T7-乱序的)产生的gRNA的抑制效率。示出了三次单独实验的平均值和标准偏差。图10示出了单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN061的载体图谱，所述单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN061表达经密码子对优化的CAS9以用于在S.cerevisiae中表达。载体上存在KanMX标记。图11示出了多拷贝(2微米)载体pRN1120的载体图谱。载体上存在NatMX标记。图12示出了单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN070的载体图谱，所述单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN070表达经密码子对优化的CAS9和在SbTDH3启动子控制下的T7RNAP以用于在S.cerevisiae中表达。载体上存在KanMX标记。图13示出了单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN071的载体图谱，所述单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN071表达经密码子对优化的CAS9和在enoI启动子控制下的T7RNAP以用于在S.cerevisiae中表达。载体上存在KanMX标记。图14示出了TOPO供体DNAfwnA的质粒图谱图15示出了BG-AMA17的质粒图谱图16示出了BG-AMA18的质粒图谱图17示出了BG-AMA19的质粒图谱序列说明SEQIDNO:1列出了用于扩增5’区段以供整合到INT1基因座中的正向引物序列。SEQIDNO:2列出了用于扩增5’区段以供整合到INT1基因座中的反向引物序列。SEQIDNO:3列出了用于扩增3’区段以供整合到INT1基因座中的正向引物序列。SEQIDNO:4列出了用于扩增3’区段以供整合到INT1基因座中的反向引物序列。SEQIDNO:5列出了整合在基因组中的GFP-dCas9-Mxi1表达单元的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含以下元件(指示的核苷酸位置)：5’INT1整合位点(1-418)；接头序列(419-468)、GFP表达盒(473-1814)；接头序列(1819-1868)；接头序列(1869-1918)；潮霉素B抗性标记盒(1923-3735)；接头序列(3747-3796)；GAL1启动子(3797-4401)；dCas9-Mxi1(4402-8736)；终止子(8737-8977)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶，用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的用途，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.23 US 62/399,1271.单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶，用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的用途，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述RNA聚合酶在所述细胞内从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述指导RNA从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。4.根据权利要求1–3中任一项所述的用途，其中所述RNA指导的核酸酶系统基于CRISPR，诸如CRISPR/Cas和CRISPR/Cpf1。5.根据权利要求1–4中任一项所述的用途，其中所述细胞是原核细胞，优选芽孢杆菌细胞，或者其中所述细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选真菌细胞。6.根据权利要求1–5中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶从诱导型启动子表达。7.根据权利要求1–6中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶是密码子优化的RNA聚合酶和/或断裂RNA聚合酶。8.根据权利要求1–7中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶在C末端或N末端具有核定位信号(NLS)，更优选地在所述RNA聚合酶的N末端具有SV40NLS。9.根据权利要求1–8中任一项所述的用途，其中从单个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子或从多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达多种不同的指导RNA。10.根据权利要求1–9中任一项所述的用途，其中所述指导RNA从来自单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子文库的一个或多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达。11.根据权利要求1–10中任一项所述的用途，其中所述单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子是变体启动子，诸如嵌合启动子。12.根据权利要求1–11中任一项所述的用途，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和/或单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子。13.根据权利要求1–12中任一项所述的用途，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，其中所述多核苷酸和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子存在于质粒上，并且其中通过将包含所述指导多核苷酸的靶序列的单链或双链寡核苷酸整合到所述质粒中而将所述质粒组装到所述细胞内。14.根据权利要求1–13中任一项所述的用途，其中所述细胞缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。15.根据权利要求1–14中任一项所述的用途，其中所述细胞表达功能性异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9，或者其中在所述细胞中存在异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9。16.一种用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的方法，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子，并且其中所述指导RNA的转录由单...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克·莫舍·杨，阿马尔·格达萨拉，瑞内·维尔瓦尔，约翰尼斯·安德列什·劳博斯，比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森，布伦达·沃恩克，亚力克·A·K·尼尔森，克里斯托弗·阿什比·沃伊特，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL