利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的重组大肠杆菌及用途制造技术

本申请提供了利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的重组大肠杆菌及用途。利用该重组大肠杆菌在葡萄糖存在下进行发酵，高效且可大规模生产，具有重要的经济价值和社会效益。

Recombinant Escherichia coli producing isopropylpyranone from glucose and its application

This application provides a recombinant E. coli for the production of isopropylpyranone from glucose and its use. The recombinant E. coli can be fermented in the presence of glucose, which is efficient and large-scale production, and has important economic value and social benefits.

【技术实现步骤摘要】
利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的重组大肠杆菌及用途相关申请本申请要求2017年10月31日提交的题目为“利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的重组大肠杆菌及用途”的中国专利申请201711047639.5的优先权，该申请的完整内容通过引用并入本文。
本申请属于生物工程
，具体地涉及一种利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的重组大肠杆菌及其用途。
技术介绍
异丙基吡喃酮是一种重要的化学产品，化学名称为4-hydroxy-6-isopropyl-2-pyrone(HIPP)，分子式为C8H10O3，分子量为154.06，CAS号为220809-37-0，结构式为在工业上，异丙基吡喃酮可作为平台化合物，合成带有支链的化合物或中间体。然而，迄今为止，本领域尚没有提供生物发酵的方式来生产异丙基吡喃酮，尚没有高效生产异丙基吡喃酮的方法。因此，本领域迫切需要开发新的、高效生产异丙基吡喃酮的方法。
技术实现思路
第一方面，提供一种利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的工程菌，其特征在于，所述工程菌为重组的大肠杆菌，并且所述重组大肠杆菌包括导入的来自枯草芽孢杆菌的BKD脱氢酶复合体的四个基因bkdF、bkdG、bkdH和lpdV1。在本文中，所述枯草芽孢杆菌的BKD脱氢酶复合体(即支链辅酶A生物合成关键酶α酮酸脱氢酶复合体)的基因可以简称为bkd基因，其包含四个基因bkdF、bkdG、bkdH和lpdV1。在一些实施方案中，所述BKD脱氢酶复合体四个基因共用一个启动子。在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌包括导入的基因alsS、ilvC和ilvD。例如，所述基因alsS可以来自枯草芽孢杆菌，所述基因ilvC和ilvD可以来自大肠杆菌。在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌中以下基因被敲除或下调：pfkA、mdh和panB。在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌包括导入的基因VPS。在一些实施方案中，所述基因VPS来自于啤酒花。在一些实施方案中，所述基因VPS如SEQIDNO.13所示。在一些实施方案中，所述基因bkd是连接有操纵子的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列为SEQIDNO.17。在一些实施方案中，所引入的基因位于一个或多个表达载体上，例如所述基因bkd和VPS位于一个表达载体上，所述基因alsS、ilvC和ilvD位于一个表达载体上。在一个实例中，所述的表达载体包括：第一表达载体，所述的第一表达载体为质粒pETDuet-bkd-operon-VPS；第二表达载体，所述的第二表达载体为质粒pCDFDuet-ACD。在一些实施方案中，所引入的基因受启动子驱动，其中，所述的启动子包括组成型或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述的启动子为T7启动子。在本文中，基因pfkA、mdh和panB可被显著下调。所述的“显著下调”指与野生型的大肠杆菌相比，某一基因在所述工程菌中所表达的相应蛋白的表达量E1或活性A1满足方程式Q1和Q2：E0/E1≥5(Q1)A0/A1≥5(Q1)式中，E0为所述基因在所述野生型大肠杆菌中所表达的相应蛋白的表达量；A0为所述基因在所述野生型大肠杆菌中所表达的相应蛋白的活性。在另一优选例中，所述的野生型大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。在另一优选例中，E0/E1≥10和/或A0/A1≥10。第二方面，提供了一种生产异丙基吡喃酮的方法，所述方法利用本文第一方面所述的工程菌在葡萄糖存在下进行发酵。在一些实施方案中，所述的发酵是在不含异丙基吡喃酮的初始发酵条件中进行。在一些实施方案中，葡萄糖的含量为10－100g/L。在一些实施方案中，所述的发酵为连续发酵或间隙式发酵。在一些实施方案中，所述方法包括步骤：(a)提供本文第一方面所述的工程菌；(b)在适合发酵的条件下并且在葡萄糖存在下，用所述的工程菌进行发酵，获得含异丙基吡喃酮的发酵产物；以及(c)任选地从所述发酵产物中分离所述的异丙基吡喃酮。在一些实施方案中，在步骤(c)，所述的分离包括：层析、HPLC或其组合。在一些实施方案中，在步骤(c)中，将发酵液用20％的(质量体积比)的大孔吸附树脂吸附，然后用2-3个柱体积洗脱杂质，然后用2-3个柱体积80％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，然后经HPLC纯化分离。在一些实施方案中，所述的发酵产物中，异丙基吡喃酮的含量为2-50mg/L。在一些实施方案中，所述的发酵产物中，异丙基吡喃酮的含量为5-25mg/L。在一些实施方案中，在所述的发酵体系中添加，或者在发酵过程中补加丙酮酸。在一些实施方案中，所述的发酵体系采用LB培养基。在一些实施方案中，所述的发酵体系采用YB培养基。第三方面，提供了一种用于生产异丙基吡喃酮的发酵体系，所述的异丙基吡喃酮的发酵体系包括：(a)用于生产异丙基吡喃酮的工程菌，所述的工程菌为本文第一方面的工程菌；(b)葡萄糖，所述的葡萄糖作为生产异丙基吡喃酮的原料；和(c)异丙基吡喃酮，所述的异丙基吡喃酮是以所述的葡萄糖为原料，通过所述工程菌的发酵而生成的。在一些实施方案中，在所述发酵体系中，所述异丙基吡喃酮的含量为2-50mg/L。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了在大肠杆菌表达菌株中生物合成异丙基吡喃酮的途径示意图。图2：A显示了包含来源于阿维链霉菌的BKD脱氢酶复合体上四个基因bkdF(E1α)、bkdG(E1β)、bkdH(E2)和lpdV1(E3)的载体pETDuet-F-G-H，其中每个基因前都有单个T7启动子用来启动基因表达。B显示了包含来源于枯草芽孢杆菌的BKD脱氢酶复合体上四个基因bkdAA(E1α)、bkdAB(E1β)、bkdB(E2)和lpdV(E3)的载体pETDuet-AA-AB-B-L，其中每个基因前都有单个T7启动子用来启动基因表达。图3比较了菌株BLBSM和BLBBS中支链酰基辅酶A的生物合成。A：菌株BLBSM与BLBBS发酵产物HPLC图。B：HPLC中保留时间为24.6min处吸收峰对应的质谱图，异丁酰辅酶A[M+H]+峰为838.2。C：HPLC中保留时间为27.8min处吸收峰对应的质谱图，异戊酰辅酶A[M+H]+峰为852.2。D：菌株BLBSM与BLBBS发酵产物中异丁酰辅酶A和异戊酰辅酶A产量对比图。图4：A显示了将枯草芽孢杆菌基因组上BKD和operon一起克隆，由一个T7启动子控制基因表达，构建了载体pETDuet-bkd-operon及菌株BLBBSO。B和C显示了对菌株BLBBSO和BLBBS进行发酵与产物检测，菌株BLBBSO与BLBBS相比，异丁酰辅酶A提高了10.5倍，异戊酰辅酶A提高了4.2倍。图5显示了对前体α-酮异戊酸合成途径进行的优化。图6显示了菌株BVBBSO和BLBBSO中异丁酰辅酶A和异戊酰辅酶A的产量。与菌株BLBBSO相比，BVBBSO的异丁酰辅酶A产量提高了60％，异丁酰辅酶A产量占总支链酰基辅酶A的91.4％。图7显示了对发酵产物进行HPLC检测的结果。其中，箭头指示的I为异丙基吡喃酮，纵坐标为吸收强度。图8显示了对于发酵产物的LC-MS检测结果。图9显示了质粒pETDuet-bk本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的工程菌，其特征在于，所述工程菌为重组的大肠杆菌，并且所述重组大肠杆菌包括导入的来自枯草芽孢杆菌的BKD脱氢酶复合体的四个基因bkdF、bkdG、bkdH和lpdV1。

【技术特征摘要】
2017.10.31 CN 20171104763951.一种利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的工程菌，其特征在于，所述工程菌为重组的大肠杆菌，并且所述重组大肠杆菌包括导入的来自枯草芽孢杆菌的BKD脱氢酶复合体的四个基因bkdF、bkdG、bkdH和lpdV1。2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述BKD脱氢酶复合体四个基因共用一个启动子。3.如权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包括导入的基因alsS、ilvC和ilvD。4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述基因alsS来自枯草芽孢杆菌，所述基因ilvC和ilvD来自大肠杆菌。5.如前述任一项权利要求所述工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：田娜，刘涛，庄以彬，毕慧萍，周威，刘茹，曹晓艳，董骧，
申请(专利权)人：创享天津生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12