C肽免疫原及其单克隆抗体对及该抗体对在C肽磁微粒化学发光免疫试剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种C肽免疫原，包括第一完全抗原和第二完全抗原，其中第一完全抗原为C肽N端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得，第二完全抗原为C肽C端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得；第一完全抗原的C肽N端氨基酸序列为C肽全长序列中的1‑12位序列，第二完全抗原的C肽C端氨基酸序列为C肽全长序列中的18‑31位序列。通过现有的合成方法即可获得抗原，并且为可用的完全抗原，制备方法简单，得到的完全抗原结构稳定；而由此通过动物免疫得到的单克隆抗体对能够分别特异性结合C肽的N端及C端，结合位点距离较远，因此不会因为空间位阻导致无法配对的情况出现，可以满足开发C肽磁微粒化学发光免疫诊断试剂及其它免疫学诊断试剂对抗体的需求。

Application of C-Peptide Immunogen and Its Monoclonal Antibody Pairs in Chemiluminescence Immunoassay of C-Peptide Magnetic Particles

The present invention provides a C-peptide immunogen, including the first complete antigen and the second complete antigen, in which the first complete antigen is obtained by coupling the N-terminal amino acid sequence of C-peptide with the carrier protein, and the second complete antigen is obtained by coupling the C-terminal amino acid sequence of C-peptide with the carrier protein; the N-terminal amino acid sequence of C-peptide of the first complete antigen is 1_12 in the full-length sequence of C-peptide, and the C-terminal of the second complete antigen. The C-terminal amino acid sequence of the peptide is 18 31 in the full-length sequence of the C-terminal peptide. Antigens can be obtained by existing synthetic methods, and can be used as complete antigens. The preparation method is simple and the structure of complete antigens is stable. The monoclonal antibodies obtained by animal immunization can specifically bind to the N and C ends of C-peptide, respectively. The binding sites are far away, so they will not be unable to pair because of steric hindrance and can meet the needs of opening. Requirements of C-peptide magnetic particle chemiluminescence immunodiagnostic reagents and other immunodiagnostic reagents for antibodies.

【技术实现步骤摘要】
C肽免疫原及其单克隆抗体对及该抗体对在C肽磁微粒化学发光免疫试剂中的应用
本专利技术涉及免疫诊断
，具体涉及一种C肽免疫原及其单克隆抗体对。
技术介绍
C肽是胰岛细胞分泌产物，与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原，如图5所示，一个分子的胰岛素原经过酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽。C肽是由31个氨基酸组成的直链多肽，其在体内清除率慢，几乎不被肝脏摄取且不受外源胰岛素影响，可以反应内生胰岛素的水平。C肽检测可以协助判定糖尿病分型；C肽检测不受胰岛抗体干扰，可以判断胰岛素治疗患者的胰岛功能；可以鉴别低血糖发生原因、有助于胰岛细胞瘤的诊断及手术效果判断；还可以根据血中C肽与胰岛素比值，判定肝肾疾病。目前临床常用的C肽检测方法主要有放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。这些技术都建立在抗原与抗体特异性相互性作用基础上，特异性的抗体对是这些检测方法的核心原材料。C肽是由31个氨基酸组成的直链多肽，属于小分子半抗原。首先，C肽免疫原性低，在抗体制备中需要与大分子链接合成完全抗原，常用的方法如中国专利CN201210555678.7及CN201810058354.X所公开的方法均采用融合表达蛋白的方法，这些方法需要基因合成、载体构建、原核表达、纯化等，操作复杂，且融合蛋白中的载体蛋白容易改变目标蛋白的结构。其次，C肽只有31个氨基酸，且其肽链中部具有优势表位，采用完整分子获得的单克隆抗体与抗原的结合点大都集中在中部区域，常常由于空间位阻力导致无法配对，影响其在诊断试剂开发中的应用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种C肽免疫原，其易于制备，且便于获取单克隆抗体对。本专利技术的技术方案是提供一种C肽免疫原，包括第一完全抗原和第二完全抗原，其中第一完全抗原为C肽N端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得，第二完全抗原为C肽C端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得，第一完全抗原的载体蛋白与第二完全抗原的载体蛋白可以相同或者不同；第一完全抗原的C肽N端氨基酸序列为C肽全长序列中的1-12位序列，第二完全抗原的C肽C端氨基酸序列为C肽全长序列中的18-31位序列。本专利技术还提供利用上述抗原通过动物免疫方法获得的单克隆抗体对。本专利技术的另一目的是提供上述单克隆抗体对在C肽磁微粒化学发光免疫试剂中的应用。上述载体蛋白包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。上述第一完全抗原和第二完全抗原中的载体蛋白相同。上述第一完全抗原中C肽N端氨基酸序列具有连接载体蛋白的连接基GGC，具体序列如SEQIDNO:1所示，SEQIDNO:1：EAEDLQVGQVELGGC，第二完全抗原中C端氨基酸序列具有连接载体蛋白的连接基CGG，具体序列如SEQIDNO:2所示，SEQIDNO:2：CGGAGSLQPLALEGSLQ。其中连接基GGC或CGG作为与载体蛋白偶联时提供连接臂及提供巯基。用于检测上述单克隆抗体对结合位点的14个短肽，其序列如SEQIDNO:3至SEQIDNO:16所示。SEQIDNO:3：EAEDLQVGQVELGGGPGSEQIDNO:4：EAEDLQVGQVELGGSEQIDNO:5：EAEDLQVGQVELSEQIDNO:6：EAEDLQVGQVSEQIDNO:7：EDLQVGQVELGGGPGSEQIDNO:8：LQVGQVELGGGPGSEQIDNO:9：VGQVELGGGPGSEQIDNO:10：GGPGAGSLQPLALEGSLQSEQIDNO:11：GGPGAGSLQPLALEGSSEQIDNO:12：GGPGAGSLQPLALESEQIDNO:13：GGPGAGSLQPLASEQIDNO:14：PGAGSLQPLALEGSLQSEQIDNO:15：AGSLQPLALEGSLQSEQIDNO:16：SLQPLALEGSLQ本专利技术的优点和有益效果：通过现有的合成方法即可获得氨基酸序列，并且可与载体蛋白偶联形成完全抗原，制备方法简单；而由此通过动物免疫得到的单克隆抗体对能够分别特异性结合C肽的N端及C端，结合位点距离较远，因此不会因为空间位阻导致无法配对的情况出现，避免采用C肽全长序列时其中部的优势表位导致难于获得结合位点较远的抗体对，可以满足开发C肽磁微粒化学发光免疫诊断试剂及其它免疫学诊断试剂对抗体的需求。附图说明图1是本专利技术N端单克隆抗体与C肽全长抗原结合位点检测结果。图2是本专利技术C端单克隆抗体与C肽全长抗原结合位点检测结果。图3是本专利技术单克隆抗体对的线性拟合图。图4是本专利技术单克隆抗体对与ElecsysC-Peptide诊断试剂盒的相关性测试图。图5是胰岛素原的氨基酸序列组成示意图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明。实施例1一、多肽合成分别合成C肽全长序列(1-31aa)EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQC(SEQIDNO:17)，N端氨基酸序列(1-12aa)EAEDLQVGQVELGGC，C端氨基酸序列(18-31aa)CGGAGSLQPLALEGSLQ，N端氨基酸序列或C端氨基酸序列中的GGC或CGG作为与载体蛋白偶联时提供连接臂及提供巯基。此外，合成短肽EAEDLQVGQVELGGGPG(1-17aa)、EAEDLQVGQVELGG(1-14aa)、EAEDLQVGQVEL(1-12aa)、EAEDLQVGQV(1-10aa)、EDLQVGQVELGGGPG(3-17aa)、LQVGQVELGGGPG(5-7aa)、VGQVELGGGPG(7-17aa)、GGPGAGSLQPLALEGSLQ(14-31aa)、GGPGAGSLQPLALEGS(14-29aa)、GGPGAGSLQPLALE(1-27aa)、GGPGAGSLQPLA(14-25aa)、PGAGSLQPLALEGSLQ(16-31aa)、13AGSLQPLALEGSLQ(18-31aa)、14SLQPLALEGSLQ(20-31aa)。二、第一完全抗原和第二完全抗原合成称取3mg的BSA溶于600ul的PBSpH7.4中；称取0.5mg的sulf-SMCC同样溶于100ul的PBS中；然后将溶解的SMCC溶液缓慢滴加进入BSA溶液中，边滴加边轻混匀，然后室温反应0.5小时；将溶液加入透析袋中，PBSpH7.4透析，除去多余的SMCC，2小时每次，更换3次透析液后将溶解好的4mgN端氨基酸序列或C端氨基酸序列缓慢滴入半偶联物中，边滴加边混匀，室温反应2小时，测浓度后直接分装冻存。实施例2一、动物免疫挑选6-8周龄身体强壮的雌性Balb/c小鼠用进行免疫。首次免疫，采用弗氏完全佐剂，100μg/小鼠，腋下多点注射；加强免疫，采用弗氏不完全佐剂，50μg/小鼠，加强免疫3次，相邻次数的加强免疫间隔时间为2周；首次免疫与第一次加强免疫间隔3周。最后一次加强免疫后1周眼球采血，C肽全长抗原包被酶标板，间接ELISA方法测定抗血清效价。融合前3天，100μg抗原/小鼠腹腔注射冲击二、细胞融合及单克隆抗体制备已提前冲击的小鼠断颈处死，75％乙醇中浸泡灭菌。超净工作台中，无菌条件下取出小鼠脾脏，用已灭菌处理的毛玻璃片挤压并轻轻研磨脾脏分离脾脏细胞，脾脏细胞计数。以SP2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种C肽免疫原，其特征在于，包括第一完全抗原和第二完全抗原，其中第一完全抗原为C肽N端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得，第二完全抗原为C肽C端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得，第一完全抗原的载体蛋白与第二完全抗原的载体蛋白相同或者不同；第一完全抗原的C肽N端氨基酸序列为C肽全长序列中的1‑12位序列，第二完全抗原的C肽C端氨基酸序列为C肽全长序列中的18‑31位序列。

【技术特征摘要】
1.一种C肽免疫原，其特征在于，包括第一完全抗原和第二完全抗原，其中第一完全抗原为C肽N端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得，第二完全抗原为C肽C端氨基酸序列与载体蛋白偶联而得，第一完全抗原的载体蛋白与第二完全抗原的载体蛋白相同或者不同；第一完全抗原的C肽N端氨基酸序列为C肽全长序列中的1-12位序列，第二完全抗原的C肽C端氨基酸序列为C肽全长序列中的18-31位序列。2.单克隆抗体对，其特征在于，利用权利要求1所述的C肽免疫原通过动物免疫方法获得的。3.权利要求2所述的单克隆抗体对在C肽磁微粒化学发光免疫试剂中的应用。4.如权利要求1所述的C肽免疫原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。5.如权利要求1所述的C肽免疫原，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹炳德，邹继华，何进军，葛超坤，贾江花，武强，赵金华，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33