一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)将高亲和聚乙二醇抗体进行包被、封闭；(2)特异性单氨基酸偶联聚乙二醇作为标准品，取步骤(1)所得结果向其中加入稀释好的标准品、生物素标记的聚乙二醇结合物，另取步骤(1)所得结果加入样品、生物素标记的聚乙二醇结合物；(3)向步骤(2)中的标准品、样品中分别加入亲和素；(4)显色反应并读取OD值，计算样品含量。解决现有检测方法无法解决的交叉反应和机体通过各种途径摄入体内的外源性聚乙二醇的干扰，可定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物。

【技术实现步骤摘要】
一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法
本专利技术涉及生物医药检测领域，具体涉及一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法。
技术介绍
聚乙二醇是一种常用的修饰剂，其毒性小，具有良好的亲和性，且生物相容性已获得FDA认可。蛋白类药物包括多肽、细胞因子、蛋白、抗体、酶等一些具有特殊功能的蛋白质。聚乙二醇化蛋白药物是聚乙二醇与蛋白类药物的化学修饰，化学修饰是延长蛋白质类药物半衰期的有效途径之一，聚乙二醇修饰可减少免疫原性，改善可溶性和生物利用度，增加抗蛋白水解作用。经聚乙二醇共价修饰后，蛋白类药物的相对分子量增加，延缓了药物排泄，从而明显改善蛋白质类药物的药动学和药效学性质。聚乙二醇化蛋白药物的代谢、组织分布和排泄研究极具挑战，幸运的是前人对于聚乙二醇分子的体内代谢机制和安全性已经确立，如聚乙二醇化干扰素的代谢研究，就明确表明不论支链还是直链的聚乙二醇与药物形成的长效干扰素，聚乙二醇均可通过粪或尿排泄，而不在体内积蓄。聚乙二醇在体内主要通过乙醇脱氢酶将聚乙二醇的乙醇基氧化成羧酸代谢，因聚乙二醇化蛋白分子中聚乙二醇分子的主要代谢点“-OH”已被占用(一个被甲基化，另一个用于蛋白氨基偶联)，故极少通过酶代谢，因此聚乙二醇化蛋白药物的代谢主要与蛋白药物酶代谢有关,聚乙二醇不会发生酶代谢。综合各种人或动物试验，相对分子质量190000以内的聚乙二醇分子，主要以原型形式从肾脏排除，较少部分经胆汁从肠道清除，因此研究肾脏或胆汁中排除的聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的含量便可分开判定代谢的聚乙二醇药物的量，为聚乙二醇化蛋白药物在体内的代谢提供辅助直观的数据。通常，采用同位素标记以及同位素标记结合高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳，酸沉淀等方法研究生物技术新药的体内组织分布和排泄。同位素标记法通常用的是同位素标记聚乙二醇分子末端羟基(-OH)结合，但聚乙二醇化蛋白药物中聚乙二醇分子游离的一段是单甲基即mPEG(CH3(-O-CH2-CH2)n-)，另一端为活化基团与蛋白的氨基偶联,故PEG化蛋白药物分子中的聚乙二醇通常没有同位素标记的适合位点。此外采用质谱等方法通过直接检测聚乙二醇代谢产物的方法研究，聚乙二醇化蛋白的体内组织分布与排泄更是受到交叉反应和机体(人或动物)通过各种途径摄入体内的外源性聚乙二醇的严重干扰。因此目前研究聚乙二醇化蛋白药物体内组织分布和排泄试验方法存在明显的缺陷和限制。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，解决现有检测方法无法克服的交叉反应和机体摄入的外源性聚乙二醇的干扰，可定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物。为实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)将高亲和聚乙二醇抗体进行包被、封闭；(2)特异性单氨基酸偶联聚乙二醇作为标准品，取步骤(1)所得结果向其中加入稀释好的标准品、生物素标记的聚乙二醇结合物，另取步骤(1)所得结果加入样品、生物素标记的聚乙二醇结合物；(3)向步骤(2)中的标准品、样品中分别加入亲和素；(4)显色反应并读取OD值，计算样品含量。将一种高亲和性的聚乙二醇抗体在固相化于酶标板上，将含聚乙二醇药物体内代谢产物的待测样本，与一定比例PEG修饰单氨酸标准品进行混合后，竞争法与包被的抗聚乙二醇抗体反应，最后通过酶促底物的强弱来计算体内聚乙二醇化蛋白代谢产物的量。本专利技术所检测样本包含从已摄入聚乙二醇化蛋白药物的个体获得样本，从已摄入聚乙二醇化蛋白药物个体可获得样品包含血清或血浆，尿液，组织匀浆液，粪便或胆汁等组织体液。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：1、本专利技术的方法不会被外源性的聚乙二醇所干扰，降低了交叉反应对检测方法的影响。2、可以检测到1.2ng/ml的聚乙二醇化蛋白药物的代谢产物。附图说明图1为本专利技术的示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明：一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)将高亲和聚乙二醇抗体进行包被、封闭；(2)特异性单氨基酸偶联聚乙二醇作为标准品，取步骤(1)所得结果向其中加入稀释好的标准品、生物素标记的聚乙二醇结合物，另取步骤(1)所得结果加入样品、生物素标记的聚乙二醇结合物；(3)向步骤(2)中的标准品、样品中分别加入亲和素；(4)显色反应并读取OD值，计算样品含量。步骤(1)中高亲和聚乙二醇抗体包括聚乙二醇抗原产生的多抗或单抗；不限于种属来源。高亲和聚乙二醇抗体包括IgM抗体。步骤(2)中特异性单氨基酸偶联聚乙二醇包括赖氨酸偶联聚乙二醇或半胱氨酸偶联聚乙二醇。步骤(2)中生物素标记的聚乙二醇结合物包括生物素通过任一化学键与至少一个聚乙二醇偶联而成；至少一个聚乙二醇结合一个生物素，也可以结合二到五个生物素分子。聚乙二醇化蛋白药物包括聚乙二醇化多肽、聚乙二醇化细胞因子、聚乙二醇化酶、聚乙二醇化抗体。所述聚乙二醇包括单链、分枝链或分叉链的聚乙二醇。所述聚乙二醇分子量为500～50000道尔顿。所述样品来源包括血清、血浆、尿液、组织匀浆液、粪便、胆汁。如图1所示，其中“1”为高吸附酶标板；“2”为包被聚乙二醇抗体；“3”为标准品或样品；“4”为生物素标记的聚乙二醇结合物；“5”为酶联标记的的链霉亲和素。步骤(1)中的包被包括高亲和抗聚乙二醇抗体包被于酶标板上，0.5μg/孔，2～8℃包被过夜；封闭包括用2％BSA封闭酶标板，250μl/孔，37℃反应2小时。步骤(2)中的标准品的处理方式包括用与样品相同的空白组织液稀释单氨基酸偶联聚乙二醇标准品，再用1％BSA进行稀释。样品处理方式包括用1％BSA进行稀释。步骤(3)中的亲和素包括链霉亲和素。实施例1犬血清中聚乙二醇化尿酸酶代谢物检测具体方法步骤：(1)包被：将聚乙二醇化抗体稀释至10μg/ml，50μl/孔，包被于酶标板上，2～8℃包被过夜。(2)封闭：用2％BSA，250μl/孔封闭，放于37℃反应2小时。(3)样品配制：取含有聚乙二醇化尿酸酶代谢物的犬血清，使用1％BSA将犬血清进行稀释。(4)标准品配制：将标准品PEG-Lys用空白犬血清分别稀释至5000ng/ml、1250ng/ml、312.5ng/ml、78.1ng/ml、19.5ng/ml、4.9ng/ml、1.2ng/ml、0ng/ml，再分别用稀释液1％BSA稀释10倍至500ng/ml、125ng/ml、31.2ng/ml、7.8ng/ml、1.95ng/ml、0.49ng/ml、0.12ng/ml、0ng/ml。(5)生物素标记的聚乙二醇化蛋白结合物用稀释液1％BSA稀释至60ng/ml。(6)将已稀释好的生物素标记的聚乙二醇化蛋白结合物和标准品加入至酶标孔内，各50μl/孔加样(复孔)，25℃，300rpm反应2小时；另外将已稀释好的生物素标记的聚乙二醇化蛋白结合物和样品加入至酶标孔内，各50μl/孔加样(复孔)，25℃，300rpm反应2小时。(7)加Avindin-HRP:用稀释液稀释1:2000倍，100μl/孔加样，25℃，300rpm，反应0.5小时。(8)显色终止及读数：分别加TMBA液和B液各50μl/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将高亲和聚乙二醇抗体进行包被、封闭；(2)特异性单氨基酸偶联聚乙二醇作为标准品，取步骤(1)所得结果向其中加入稀释好的标准品、生物素标记的聚乙二醇结合物，另取步骤(1)所得结果加入样品、生物素标记的聚乙二醇结合物；(3)向步骤(2)中的标准品、样品中分别加入亲和素；(4)显色反应并读取OD值，计算样品含量。

【技术特征摘要】
1.一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将高亲和聚乙二醇抗体进行包被、封闭；(2)特异性单氨基酸偶联聚乙二醇作为标准品，取步骤(1)所得结果向其中加入稀释好的标准品、生物素标记的聚乙二醇结合物，另取步骤(1)所得结果加入样品、生物素标记的聚乙二醇结合物；(3)向步骤(2)中的标准品、样品中分别加入亲和素；(4)显色反应并读取OD值，计算样品含量。2.根据权利要求1所述的一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，其特征在于：步骤(1)中高亲和聚乙二醇抗体包括聚乙二醇抗原产生的多抗或单抗。3.根据权利要求2所述的一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，其特征在于：高亲和聚乙二醇抗体包括IgM抗体。4.根据权利要求1所述的一种定量分析体内聚乙二醇化蛋白药物代谢产物的检测方法，其特征在于：步骤(2)中特异性单氨基酸偶联聚乙二醇包括赖氨酸偶联聚乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：白艳敏，朱云祯，陈婕，刘蒙蒙，范开，
申请(专利权)人：重庆派金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50