用于脑中风的发光ELISA体液样品稳定化用水溶液制造技术

本发明专利技术提供一种用于发光ELISA的体液样品稳定化用水溶液，该体液样品中含有神经损伤标志性蛋白成分，在该体液样品稳定化用水溶液中，溶质包括人血清、动物血清白蛋白、无机碱金属盐、Tris碱、蛋白变性剂以及非离子型表面活性剂，该水溶液的pH值为6.7～7.6。在使用ELISA法从体液样品(例如，外周血液)中检测神经细胞损伤标志物蛋白成分NF‑H时，本发明专利技术的体液样品稳定化用水溶液能够有效降低体液样品中其它成分的干扰，提高检测结果的准确性和可重复性，并且可以将体液中pg级别的NF‑H稳定而准确地检测出来，从而可以对脑中风患者的患病程度、治疗效果、预后等进行诊断。

【技术实现步骤摘要】
用于脑中风的发光ELISA体液样品稳定化用水溶液
本专利技术涉及生物医学检测领域，具体地说，涉及一种针对脑卒中(脑中风)患者的体液样品稳定化用水溶液、体外检测试剂盒、以及检测系统。
技术介绍
脑卒中俗称中风，由脑血管阻塞或破裂导致的脑损伤引起，危害十分严重。流行病学研究发现，当今我国中风的致残率排名第一，病死率排名第二，仅次于癌症。没有哪种疾病能够像中风一样，瞬间令人口眼歪斜、四肢麻木、瘫痪在床，让人失去生活尊严。目前，我国每年新增中风病例超过370万，存活的脑卒中患者近2000万人，且患者数量处于急速上升期。高血压、糖尿病、心脏病都是脑中风的危险因素，中老年人是中风高危人群。因此，需要建立快速而准确的诊断脑卒中的方法。当今脑中风的诊断方法以影像学为主，精确度低、费用高昂，给社会卫生事业带来重大负担。加之中风患者病情变化迅速、个体差异明显，给诊断与治疗带来巨大困难。除影像学诊断外，在诊断脑中风的方法中，还有一种利用ELISA检测脑脊液中神经丝蛋白(neurofilamentprotein，NFP)含量的方法。神经丝蛋白(NFP)是中枢神经系统含量最高的蛋白之一，是构建神经丝-神经细胞相互通信联络的通道的主要成分。神经丝蛋白由三种特定的蛋白亚基(NF-L，NF-M，NF-H)组装而成。急性缺血性脑卒中直接造成大量的神经细胞死亡，而死亡的神经细胞则分解并释放出大量的结构蛋白，其中包括NF-H。因血脑屏障的原因，NF-H大都滞留在脑脊液。要检测脑脊液中的NF-H，通常采用脊髓穿刺的方法。但是，该方法给患者再次造成严重身心痛苦，给社会和家庭带来巨大医疗负担。作为检测脑脊液中NF-H的一种方法，较为普遍的是酶联免疫吸附检测(ELISA)法，其基本原理是利用抗原、抗体的特异性反应，用已知抗原或抗体检测未知抗原或抗体。由于ELISA试验方法具有敏感、特异、经济、简便、安全等特点，目前在疾病的诊断和疗效观察以及预防医学等方面应用尤为广泛。作为一种测定微量抗原、抗体的经典方法，ELISA法广泛应用于临床检验诊断，其技术成熟，用途广泛，分析灵敏度高、分析特异性好，操作简单。基本操作过程为：第一步，将抗原(或抗体)包被于固相载体(如聚苯乙烯塑料酶标板)上，放4℃冰箱过夜。第二步，用缓冲液洗包被板三次，加待测标本后放37℃温箱(或室温)反应1～2.5小时。第三步，用缓冲液洗板三次，加酶标抗体后置37℃温箱(或室温)反应1～2.5小时。第四步，用缓冲液洗板三次，加底物液显色，硫酸中止反应，上机判断结果。作为ELISA发展的最新技术，发光ELISA将发光基团耦联到探测抗体，直接测量其所发光量来对抗原进行定量，既减少了酶/底物反应带来的附加干扰，又在极大程度上提高了探测灵敏度。无论是通过影像学诊断还是ELISA脑脊液检测，目前，脑中风诊断的主要难点有：早期无症状或轻度症状，难以检测；实时诊断难以区分出血性中风或缺血性中风；长期治疗无法判断受损细胞类型和/或治疗效果，造成中风诊断水平普遍低下。因此，早期诊断、快速诊断、精确诊断，特别是无需脊髓穿刺获取脑脊液就能完成这样的诊断，对于降低脑中风的致残率和致死率具有特别重要的作用。
技术实现思路
本专利技术人对脑中风患者的体液样品特别是外周血进行了长期而深入的研究，结果发现，也有极微量(＜100pg/mL)的NF-H进入外周血液系统。基于该发现，本专利技术提供了一种技术手段，对以外周血血清为代表的体液进行发光ELISA检测，测定该外周血血清中的标志性蛋白成分(例如NF-H)的浓度，以此实现对脑卒中的诊断，同时还能避免高危险性的脊髓穿刺。发光ELISA的特点是具有识别微弱信号的能力，其灵敏度为传统的、以酶催化为基础的ELISA的10～1,000倍。这种检测灵敏度的大幅提高，对检测系统分辨信号真假阳性的能力提出了极高的要求，尤其是检测试剂的作用。为了使发光ELISA在增强信号的同时能够降低噪音从而显著降低假阳性，本专利技术第一方面提供一种用于发光ELISA的体液样品稳定化用水溶液，该体液样品中含有神经损伤标志性蛋白成分，在该体液样品稳定化用水溶液中，溶质包括人血清、动物血清白蛋白、无机碱金属盐、Tris碱、蛋白变性剂以及非离子型表面活性剂，该水溶液的pH值为6.7～7.6。优选的是所述体液样品稳定化用水溶液的pH值为7.0～7.4。所述动物血清白蛋白来自牛、羊、马、兔、鸡，并且优选为牛血清白蛋白。优选的是，在每100ml所述体液样品稳定化用水溶液中，人血清的浓度为10体积％～50体积％；牛血清白蛋白的浓度为0.1质量/体积％～10质量/体积％；无机碱金属盐的浓度为110mM～200mM；Tris碱的浓度为10mM～25mM；蛋白变性剂的浓度为0.01mM～0.5mM，以及非离子型表面活性剂的浓度为0.05体积％～5.0体积％。无机碱金属盐优选选自碱金属盐酸盐；蛋白变性剂选自尿素和十二烷基硫酸钠；所述非离子型表面活性剂选自吐温-20，吐温-40，吐温-60，吐温-80和TritonX-100。优选的是，所述无机碱金属盐为氯化钠和氯化钾，所述蛋白变性剂为尿素，所述非离子表面活性剂为吐温-20。更优选的是，在每100ml所述体液样品稳定化用水溶液中，所述人血清的浓度为10体积％～35体积％；所述牛血清白蛋白的浓度为0.5质量/体积％～5质量/体积％；吐温-20的浓度为0.1体积％～3.0体积％；尿素的浓度为0.05mM～0.25mM氯化钠的浓度为110mM～150mM；氯化钾的浓度为2.0mM～3mM；以及Tris碱的浓度为15mM～25mM。所述氯化钠、氯化钾和所述Tris碱的至少一部分以Tris缓冲盐水的形式提供。所述神经损伤标志性蛋白成分选自神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NFP)、神经丝蛋白(NFP)重链(NF-H)、神经丝蛋白(NFP)中链(NF-M)、神经丝蛋白(NFP)轻链(NF-L)以及神经烯醇化酶。所述体液为血液、血清、脑脊液、组织液、尿液、唾液或者汗液，优选为人外周血血清。更优选的是，所述人外周血血清中含有NF-H作为所述神经损伤标志性蛋白成分；进一步更优选的是，每毫升所述人外周血血清中所含的NF-H为pg级水平。所述人外周血血清来自无症状志愿者、轻微症状的脑中风患者、脑中风急性期患者、脑中风恢复期患者、或脑中风后遗症期患者。所述发光ELISA为双抗体夹心法ELISA。本专利技术第二方面提供一种用于发光ELISA的体外诊断试剂盒，包括上述第一方面所述的体液样品稳定化用水溶液，以及任选地包括的抗所述神经损伤标志性蛋白成分的抗体。所述的抗所述神经损伤标志性蛋白成分的抗体优选为抗NF-H蛋白抗体。所述抗NF-H蛋白抗体包括：捕捉抗体和探测抗体；其中所述捕捉抗体和所述探测抗体为分别针对NF-H蛋白不同抗原表位的抗NF-H抗体。优选的是，所述探测抗体上耦联有发光基团。所述发光基团的发光方式包括化学方式或者物理方式，所述化学方式优选包括酶催化或者化学发光，所述物理方式优选包括电致发光、荧光、以及荧光共振能量转移中的任意一者。优选的是，所述捕捉抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，并且所述探测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。所述多克隆抗体来自小鼠、兔、鸡、羊、豚鼠、驴、马中的任意一者。本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于发光ELISA的体液样品稳定化用水溶液，所述体液样品中含有神经损伤标志性蛋白成分，在该体液样品稳定化用水溶液中，溶质包括人血清、动物血清白蛋白、无机碱金属盐、Tris碱、蛋白变性剂以及非离子型表面活性剂，该水溶液的pH值为6.7～7.6。

【技术特征摘要】
2017.10.20 CN 20171098483101.一种用于发光ELISA的体液样品稳定化用水溶液，所述体液样品中含有神经损伤标志性蛋白成分，在该体液样品稳定化用水溶液中，溶质包括人血清、动物血清白蛋白、无机碱金属盐、Tris碱、蛋白变性剂以及非离子型表面活性剂，该水溶液的pH值为6.7～7.6。2.根据权利要求1所述的体液样品稳定化用水溶液，其中，所述无机碱金属盐选自碱金属盐酸盐；所述蛋白变性剂选自尿素和十二烷基硫酸钠中的至少一者；所述非离子型表面活性剂选自吐温-20，吐温-40，吐温-60，吐温-80和TritonX-100中的至少一者，所述动物血清白蛋白来自牛、羊、马、兔、鸡，并且优选为牛血清白蛋白。3.根据权利要求1所述的体液样品稳定化用水溶液，其中，所述神经损伤标志性蛋白成分选自神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NFP)、神经丝蛋白重链(NF-H)、神经丝蛋白中链(NF-M)、神经丝蛋白轻链(NF-L)以及神经烯醇化酶中的至少一者。4.根据权利要求2所述的体液样品稳定化用水溶液，其中，所述人血清的浓度为10体积％～50体积％；所述牛血清白蛋白的浓度为0.1质量/体积％～10质量/体积％；所述无机碱金属盐的浓度为110mM～200mM；所述Tris碱的浓度为10mM～25mM；所述蛋白变性剂的浓度为0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓杰，丁维俊，夏巍，
申请(专利权)人：成都蓝瑙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51