聚乙二醇化天花粉蛋白药物及其制备方法技术

一种聚乙二醇化天花粉蛋白药物，其特征在于：由聚乙二醇和天花粉蛋白的Ｎ末端通过胺键连接，且一个ＴＣＳ分子结合一个聚乙二醇分子所组成。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术所要保护的技术方案属于聚乙二醇化天花粉蛋白药物及其生产工艺这一

技术介绍
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)块根中提取的的一种蛋白质。它具有多种生物学和药学功能，临床应用于引产及宫外孕、葡萄胎、绒癌的治疗。1989年美国学者McGrath等发现我国传统引产中药TCS在体外不仅能抑制T淋巴细胞内HIV的复制，而且对单核/巨噬细胞内的HIV复制也有抑制作用。二十世纪九十年代初在美国进行的I期和II期临床试验证明来源于中国的TCS不仅能有效地抑制T淋巴细胞内的HIV的复制，而且对单核/巨噬细胞内的HIV复制也有显著的抑制作用。杀灭被HIV感染的单核/巨噬细胞，可以消除HIV的贮存库，从而真正降低机体的感染程度。TCS对没有被HIV感染的细胞无杀伤作用，不抑制骨髓的造血功能，从而不影响免疫功能的恢复。这些特点是它优于目前临床使用的抗HIV药物如AZT等核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂的重要方面，代表着新一类抗HIV药物的研究方向。然而TCS是异体蛋白，具有强的免疫原性，易引起全身性过敏反应，体内半衰期较短，这些缺点限制了它在临床上的广泛应用。聚乙二醇(PEG)是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过共价键结合方式修饰蛋白质。聚乙二醇修饰蛋白质药物不仅可以降低免疫原性和毒性、而且能明显延长血浆半衰期，提高蛋白质药物的稳定性。利用PEG对其进行修饰，可以减少蛋白质分子通过肾脏的排泄，延长体内半衰期，减少用药次数，增加治疗的有效性。聚乙二醇修饰蛋白质技术已广泛应用于生物医药领域，迄今PEG修饰蛋白质和其它化合物至少有四十余种。FDA已批准的PEG化产品有聚乙二醇化腺苷脱氨酶、聚乙二醇化天冬脐胺酶、聚乙二醇化干扰素、聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子等。专利号为PCT/US94/01618(Ribosome inactivating proteincompositions having reduced antigenicity)的专利公开了一种采用分子量为5000的mPEG-SC修饰TCS的方法，所得到的修饰产物单一性和均一性均较差，难以分离纯化，且得率也非常低，稳定性差，无法获得符合临床应用的产品。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题提供一种有利于工业化生产，产物均匀、稳定性好，且具有极低的全身性过敏反应，能重复多次使用的聚乙二醇化天花粉蛋白药物及制备方法。本专利技术解决技术问题的方案是一种聚乙二醇化天花粉蛋白药物，由聚乙二醇和天花粉蛋白的N末端通过胺键连接，且一个TCS分子结合一个聚乙二醇分子所组成。本专利技术的方案是基于这样的认识所提出的现有技术的聚乙二醇化天花粉蛋白药物是采用专利号为PCT/US94/01618公开的技术利用mPEG-SC修饰TCS，由于mPEG-SC足以与蛋白质分子中赖氨酸残基中游离的氨基结合，因此该专利得到的修饰产物为每个TCS结合3-5个PEG分子的混合物，故而所得到的修饰产物单一性和均一性差，难以分离纯化，且得率也非常低，无法获得符合临床应用的产品。本专利技术药物的分子结构是一个聚乙二醇分子与TCS分子的N末端结合，因此其单一性和均一性高，也很容易纯化，并且纯化产物的活性能较好地保留，且只有极低的全身性过敏反应，能重复多次使用。与天花粉蛋白的N末端相连接的分子为甲氧基聚乙二醇活化分子。具体为一个单甲氧基聚乙二醇醛。本专利技术提供生产上述结构的聚乙二醇化天花粉蛋白的技术方案是聚乙二醇与天花粉蛋白发生还原性烷基化反应的重量比例(W/W)在0.5-20之间，发生还原性烷基化反应的缓冲体系的pH值在3-8之间，还原性烷基化反应的温度在4-37℃之间，还原性烷基化反应的时间是4-48小时。按照此种方法所得的产品均具有较好的单一性和均一性。上述的聚乙二醇是分子量在10000-40000Da之间单甲氧基聚乙二醇活化分子。具体可以是单甲氧基聚乙二醇活化分子可以是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丁二酸酯、或是是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基碳酸酯、或是单甲氧基聚乙二醇醛，最优选的是单甲氧基聚乙二醇醛，其分子量可以在5000-40000Da之间。分析TCS序列(247个氨基酸，理论分子量27143.73)如下DVSFRLSGATSSSYGVFISNLRKALPNERKLYDIPLLRSSLPGSQRYALIHLTNYADETISVAIDVTNVYIMGYRAGDTSYFFNEASATEAAKYVFKDAMRKVTLPYSGNYERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSAITTLFYYNANSAASALMVLIQSTSEAARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLAIISLENSWSALSKQIQIASTNNGQFESPVVLINAQNQRVTITNVDAGVVTSNIALLLNRNNMA单甲氧基聚乙二醇(mPEG)活化分子对TCS的N端选择性都较高，所以确定上述聚乙二醇化天花粉蛋白药物中与天花粉蛋白的N末端相连接的分子为分子量在10000-40000Da之间的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)活化分子，单甲氧基聚乙二醇活化分子可以是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丁二酸酯(mPEG-SS)、也可以是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG-SC)、也可以是单甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-ALD)，在这种分子量之间的mPEG活化分子对天花粉蛋白的N末端选择性高，从而可以保证它们具有较好的单一性和均一性。但是最优选的是单甲氧基聚乙二醇醛。这是由于TCS的N末端对该活化分子的选择性明显高于TCS的其它的N端对该活化分子的选择性，所以比起其它的活化分子来说可以使产物的均一性得到大大提高，而且能够使用的分子量范围也可以扩展到5000-40000Da。聚乙二醇与天花粉蛋白发生还原性烷基化反应优化方案是聚乙二醇与天花粉蛋白发生还原性烷基化反应的比例(W/W)在4-10之间，pH值在4-7之间，温度在8-25℃之间，时间为16-24小时之间。在以上聚乙二醇化天花粉蛋白发生还原性烷基化反应添加的催化剂是NaCNBr。单甲氧基聚乙二醇醛具体的修饰反应过程是(1)提供离子强度为10-500mmol/L、pH4.5-6.5的缓冲体系；(2)天花粉蛋白与单甲氧基聚乙二醇醛分子在步骤(1)提供的体系中反应18-22小时，温度控制在18-25℃；使用用量为5～100mM的NaCNBr为催化剂；(3)经步骤(2)反应得到的产物经过阳离子交换树脂吸附后，用盐洗脱，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个天花粉蛋白分子的聚乙二醇化天花粉蛋白洗脱峰，经浓缩处理后上分子筛凝胶色谱柱分离纯化，收集一个聚乙二醇分子连接一个天花粉蛋白分子的聚乙二醇化天花粉蛋白。本专利技术提出的技术方案能较好地利用聚乙二醇对天花粉蛋白的N末端选择性高的修饰方法，即聚乙二醇活性分子和天花粉蛋白的N末端通过胺键方式连接，不仅使产物的单一性，而且使其均一性都得到大大提高，从而容易纯化和分离，具有较高的收率，使工业化生产变得容易；同时纯化产物的活性能够较好地保留，同时具备了高的引产活性、抗HIV活性和抗肿瘤活性以及极低的全身性过敏反应和能重复多次使用的特点。附图说明图1和图2为实施例7所得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇化天花粉蛋白药物，其特征在于由聚乙二醇和天花粉蛋白的N末端通过胺键连接，且一个TCS分子结合一个聚乙二醇分子所组成。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化天花粉蛋白药物，其特征在于与天花粉蛋白的N末端相连接的分子为单甲氧基聚乙二醇活化分子。3.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化天花粉蛋白药物，其特征在于天花粉蛋白的N末端相连接的分子为一个单甲氧基聚乙二醇醛。4.一种如权利要求1所述的聚乙二醇化天花粉蛋白药物的制备方法，其特征在于聚乙二醇与天花粉蛋白发生还原性烷基化反应的重量比例(W/W)在0.5-20之间，发生还原性烷基化反应的缓冲体系的pH值在3-8之间，反应的温度在4-37℃之间，反应的时间是4-48小时。5.根据权利要求4所述的聚乙二醇化天花粉蛋白药物的制备方法，其特征在于所述的聚乙二醇是分子量在10000-40000Da之间单甲氧基聚乙二醇活化分子。6.根据权利要求4所述的聚乙二醇化天花粉蛋白药物的制备方法，其特征在于所述的聚乙二醇是分子量在5000-40000Da之间单甲氧基聚乙二醇醛。7.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋礼华，戎隆富，王荣海，
申请(专利权)人：安徽安科生物工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：