一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，包括以下步骤：（1）乙醛酸上的羧基与生物素进行连接，制得生物素修饰的乙醛酸作为氨基残留物检测的通用中间体；（2）将步骤（1）制得的氨基残留物检测的通用中间体加入样本中，与样本中的氨基残留物发生反应，通过萃取得到带有生物素修饰的乙醛酸的氨基残留物衍生物；（3）使用链霉亲和素包板，氨基残留物衍生物作为待检测物，氨基残留物抗体、二抗分别孵育后显色得到吸光值。本发明专利技术以生物素作为间接检测对应，实现对目标物的间接检测。通过生物素与亲和素的信号放大作用，可以增加滞留在酶标板上的氨基残留物的含量，进而提高检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法
本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法。
技术介绍
食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题。作为WTO的新成员，我国与世界各国间的贸易往来日益增加，食品安全已经成为影响农业和食品工业竞争力的关键因素，并在某种程度上制约了我国农业产业结构和食品工业的战略性调整。目前，全球食品安全形势不容乐观，主要表现为食源性疾病、恶性食品污染不断上升和部分食品生产加工新技术与新工艺带来新的危害。近几年，影响最大的食品安全问题存在以下几个方面，如猪肉中的瘦肉精（盐酸克伦特罗）残留，肠出血性大肠杆菌O157:H7食物中毒，化学污染物如二噁英、农药和兽药残留的污染造成广泛的食品污染，对人体健康具有长期和严重的潜在健康危害。在检测技术方面，不少尚属空白或不能够完善，不能满足食品安全控制的需要。因此，随着经济的发展，大多数国家开始对食品的安全性问题提出更高的要求，检测技术日益趋向于高技术化、系列化、速测化、便携化和易商品化发展。酶联免疫吸附剂测定技术即ELISA，因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性，仍然表现出其独特的优势并在农药残留、兽药残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人兽共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域中有着广泛的发展前景。然而为了进一步满足现有食品安全检测的需求，需要进一步对传统的ELISA检测方法进行创新，满足高灵敏度的检测需求。
技术实现思路
为了解决以上现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，该方法可以同时适用于氨基残留物的检测。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，包括以下步骤：（1）乙醛酸上的羧基与生物素进行连接，制得生物素修饰的乙醛酸，作为氨基残留物检测的通用中间体；（2）将步骤（1）制得的氨基残留物检测的通用中间体加入样本中，与样本中的氨基残留物发生反应，通过萃取得到带有生物素修饰的乙醛酸的氨基残留物衍生物；（3）使用链霉亲和素包被96孔板，再用封闭液封闭；然后加入步骤（2）提取的衍生物于37℃条件下孵育，孵育完成后洗板烘干；再加入氨基残留物的抗体于37℃条件下孵育，孵育完成后洗板烘干，最后加入识别氨基残留物的抗体的酶标二抗孵育，孵育后加入显色液显色。进一步的，所述生物素为氨基聚乙二醇生物素，生物素通过氨基与乙醛酸的羧基相连接。进一步的，所述氨基残留物包括金刚烷胺、磺胺类、克仑特罗、或抗生类，所述磺胺类包括磺胺甲基嘧啶（磺胺甲嘧啶）、磺胺甲恶唑（磺胺甲鯻唑）、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶（磺胺地索辛）、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉（磺胺喹沙啉），所述抗生类包括庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、链霉素或新霉素。进一步的，所述步骤（3）的具体操作方法为：a．将1mg/mL的链霉亲和素作为包被原液，用0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被原液以1:5000-1:10000的稀释比进行稀释，作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，200μL/孔，于37℃烘箱封闭2h；用洗液洗板3-5次，并将酶标板拍干；b．每孔分别加入100μL以标准品稀释液PBST稀释的氨基残留物衍生物，于37℃烘箱中孵育30min，所述标准品稀释液PBST为含0.05％吐温-20、pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液；用洗液洗板3-5次，并将酶标板拍干；c.将1mg/mL的氨基残留物的抗体以1:5000-1:8000比例稀释，100μL/孔加入酶标板中，于37℃条件下孵育1h；用洗液洗板3-5次，并将酶标板拍干；d.将稀释后的2μg/mL的酶标二抗以100μL/孔加入酶标板中，于37℃条件下孵育30min；用洗液洗板3-5次，并将酶标板拍干；e.将显色液以100μL/孔加入酶标板中，于37℃条件下孵育显色10-15min；然后以50μL/孔加入终止液，将酶标板放到酶标仪上读取450nm吸光值。本专利技术的工作原理为：乙醛酸上的羧基与氨基聚乙二醇生物素上的氨基进行化学交联，乙醛酸上的醛基与带有氨基的残留物发生化学交联，将修饰了生物素的乙醛酸加入均质的组织样本中，乙醛酸上的醛基即可与组织样本中氨基残留物的氨基发生反应，通过萃取得到带有生物素修饰的乙醛酸的氨基残留物衍生物；使用链霉亲和素包被酶标板，与氨基残留物衍生物孵育后，链霉亲和素与生物素发生亲和结合，从而使得与生物素连接的氨基残留物滞留在酶标板上，使用氨基残留物抗体结合酶标板上滞留的氨基残留物，然后再使用酶标二抗与氨基残留物抗体相识别，最后根据显色的数值大小确定样本中氨基残留物的含量。本方法中标准曲线用到的标准物质溶液，为生物素的乙醛酸与对应的检测物质反应后得到的物质溶液。有益效果：本专利技术提供了一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，本专利技术以乙醛酸作为用于氨基残留物检测的通用中间体，其能够与带有氨基的残留物发生化学交联，通过萃取得到带有生物素修饰的乙醛酸的氨基残留物衍生物后，以生物素作为间接检测对应，实现对目标物的间接检测。通过生物素与亲和素的信号放大作用，可以增加滞留在酶标板上的氨基残留物的含量，进而提高检测的灵敏度。本专利技术中建立的方法待检测物质随着浓度的增加，OD450nm也随之增加，与常规的小分子类ELISA方法负相关的对应关系不同（待检测物质随着浓度的增加，OD450nm随之减少），可以避免因为环境、基质效应导致的OD值降低而导致的假阳性。本专利技术所述的生物素亲和素的放大系统与现有的应用于ELISA方法的放大系统相比，省略了制备生物素标记的抗体和亲和素标记的酶标二抗的操作步骤，生物素标记抗体和亲和素标记酶标二抗的过程均会导致抗体的损耗，造成原料浪费，特别是对于价格昂贵的稀有抗体，不仅会影响抗体的得率，同时影响产品的产量，进而降低了产品的产值；同时，抗体经标记后会影响其空间结构，若抗体的被标记位置正好位于其识别位点，则会对抗体与目标物的识别与结合产生影响，从而影响检测方法的构建。同时，本专利技术未使用包被原，即偶联蛋白质的标准品，简化了原料的制备操作。因此，本专利技术在保证产品质量的同时，提高了传统ELISA检测方法的灵敏度，通过对金刚烷胺、磺胺间甲氧嘧啶、克仑特罗、新霉素这几种物质检测的标准曲线得知，计算得出的检测线能够完全满足现有检测需求。该方法同时适用于含有氨基残留物的检测，其作为免疫检测方法对氨基残留物的检测起到重要的作用。附图说明图1为实施例1中检测金刚烷胺的标准曲线图。图2为实施例2中检测磺胺间甲氧嘧啶的标准曲线图。图3为实施例3中检测克仑特罗的标准曲线图。图4为实施例4中检测新霉素的标准曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。以下实施例所述的生物素修饰的乙醛酸的制备方法如下：（1）醛基的保护：在干燥洁净的100mL两口本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）乙醛酸上的羧基与生物素进行连接，制得生物素修饰的乙醛酸，作为氨基残留物检测的通用中间体；（2）将步骤（1）制得的氨基残留物检测的通用中间体加入样本中，与样本中的氨基残留物发生反应，通过萃取得到带有生物素修饰的乙醛酸的氨基残留物衍生物；（3）使用链霉亲和素包被96孔板，再用封闭液封闭；然后加入步骤（2）提取的衍生物于37℃条件下孵育，孵育完成后洗板烘干；再加入氨基残留物的抗体于37℃条件下孵育，孵育完成后洗板烘干，最后加入识别氨基残留物的抗体的酶标二抗孵育，孵育后加入显色液显色。

【技术特征摘要】
1.一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）乙醛酸上的羧基与生物素进行连接，制得生物素修饰的乙醛酸，作为氨基残留物检测的通用中间体；（2）将步骤（1）制得的氨基残留物检测的通用中间体加入样本中，与样本中的氨基残留物发生反应，通过萃取得到带有生物素修饰的乙醛酸的氨基残留物衍生物；（3）使用链霉亲和素包被96孔板，再用封闭液封闭；然后加入步骤（2）提取的衍生物于37℃条件下孵育，孵育完成后洗板烘干；再加入氨基残留物的抗体于37℃条件下孵育，孵育完成后洗板烘干，最后加入识别氨基残留物的抗体的酶标二抗孵育，孵育后加入显色液显色。2.根据权利要求1所述的一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，其特征在于，所述生物素为氨基聚乙二醇生物素，生物素通过氨基与乙醛酸的羧基相连接。3.根据权利要求1所述的一种适用于氨基残留物的高灵敏ELISA检测方法，其特征在于，所述氨基残留物包括金刚烷胺、磺胺类、克仑特罗、或抗生类，所述磺胺类包括磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉，所述抗生类包括庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、链霉素或新霉素。4.根据权利要求1所述的一种适用于氨基残留物的高...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勋，
申请(专利权)人：江苏美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32