一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术属于油菜育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记及其应用，该分子标记综合使用可预测油菜菌核病茎杆抗性的相对高低。以油菜单株的总DNA为模板，利用上述两个引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离，可分别获得一条特异条带，能同时扩增出上述两条特异条带的个体判断为含有标记对应抗病QTL的材料，预测其茎杆抗性水平相对较高，可以保留进入后期的抗性鉴定。本发明专利技术开发的分子标记可用于油菜菌核病茎杆抗性的鉴定和预测，操作简便，方法易行，解决了常规育种方法中存在的必须到后期才能选择鉴定等问题，减轻了后期工作量，加快了油菜菌核病抗性改良的育种进程。

A molecular marker closely related to stem resistance to Sclerotinia sclerotiorum in rapeseed and its application

The invention belongs to the technical field of rape breeding and molecular biology, and specifically relates to a molecular marker closely related to stem resistance to Sclerotinia sclerotiorum of rape and its application. The comprehensive use of the molecular marker can predict the relative level of stem resistance to Sclerotinia sclerotiorum of rape. Using the total DNA of menu strain as template, the two primers mentioned above were used for PCR amplification. The amplified products were separated by electrophoresis, and a specific band could be obtained. Individuals who could amplify the two specific bands at the same time could be judged as materials containing markers corresponding to disease-resistant QTLs. It was predicted that the resistance level of stem was relatively high and could be retained for later resistance identification. The molecular marker developed by the invention can be used for the identification and prediction of stem resistance to Sclerotinia sclerotiorum in rapeseed. The method is simple and easy to operate. It solves the problems existing in conventional breeding methods, such as selecting and identifying only at later stage, reduces the workload at later stage, and speeds up the breeding process of improving the resistance to Sclerotinia sclerotiorum in rapeseed.

【技术实现步骤摘要】
一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记及应用
本专利技术属于油菜育种和分子生物学领域，具体涉及一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，同时还涉及该分子标记在选育抗菌核病油菜中的应用。
技术介绍
中国是油菜(甘蓝型油菜)的种植大国，占全世界油菜种植面积的三分之一，但我国油菜的单产一直处于世界平均水平，每年因油菜菌核病危害而导致的油菜减产约10～80％。选育抗病品种是解决油菜菌核病危害最经济有效的途径，育种家们通过系统选育，培育了一批耐病的油菜品种，比如‘中油821’和‘中双’系列品种等，这些品种的推广种植在一定程度上减轻了菌核病给生产带来的危害。但是在油菜抗菌核病育种过程中存在几个关键难点，主要是无优质抗源、无可用的分子标记、后期抗性鉴定工作量大等，致使油菜抗菌核病育种进程缓慢。利用一些具有部分抗性的油菜材料，国内外学者先后定位了很多与油菜菌核病抗性相关的QTL，这些QTL分布在C01，C02，C03，C06，C09，A02，A03，A08,A09,A10等染色体上，近来有学者还通过全基因组关联分析、转录组测序等技术，在油菜中筛选到一些跟菌核病抗性相关的基因。尽管找到诸多QTL，但可利用于油菜抗菌核病育种的分子标记目前尚鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，该分子标记可直接在油菜菌核病茎杆抗性育种中应用，通过该分子标记可对油菜进行早期鉴定和辅助选择，可尽早淘汰不含标记所在抗病QTL的个体，选择出含抗病QTL、具有较好抗性的个体进入后期的抗性鉴定程序，减轻后期表型鉴定及繁育工作，有效提高选择效率。获得上述与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记的具体过程如下：1)以一份感菌核病甘蓝与一份抗病甘蓝(Brassicaincana)杂交产生F1代，F1代自交种通过组培手段将每个F2基因型扩繁至20个拷贝，生根后种植于大田，获得149个F2代无性系。2)于苗期提取每个F2无性系幼嫩叶片的DNA进行全基因组分子标记，采用图谱构建软件构建甘蓝的遗传连锁图谱；于开花后2周进行茎杆菌核病抗性鉴定，获得表型数据。3)采用QTL扫描软件，结合遗传连锁图谱与表型数据进行QTL扫描，在C09染色体上获得2个主效抗病QTL。4)将主效QTL“qC09-2”侧翼标记与甘蓝参考基因组对应，找出QTL对应物理区间，从中设计SSR引物，并将在甘蓝F2群体中有多态性的标记加密到图谱中。5)加密后的QTL“qC09-2”区间覆盖6个标记，通过在抗病甘蓝、感病甘蓝和3份油菜中扩增鉴定，其中在抗病甘蓝与其他材料间存在多态性的两个分子标记为本专利技术所述与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记。本专利技术所述的一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，包括SWUC797和SWUC934，所述SWUC797和SWUC934的正向引物序列和反向引物序列依次如下所示：标记名称正向引物序列(5'→3')反向引物序列(5'→3')SWUC797GGACTTACTGCAACGGGAAAATTCTCTCGAACTTCGCCCTSWUC934TTCACACTCCCGATCTCTCCAGATTCCCTCCCCAACAAGT6.本专利技术所述分子标记在鉴定油菜菌核病抗性中的应用，优选的，所述分子标记鉴定油菜菌核病抗性在油菜抗菌核病育种中的应用。上述分子标记在鉴定油菜菌核病抗性中应用的方法如下：(1)以待鉴定油菜单株总DNA为模板，利用SWUC797和SWUC934分别进行PCR扩增分别得到扩增产物①和②；(2)将扩增产物①和②分别进行凝胶电泳，若扩增产物①中观察到180bp的特异条带同时扩增产物②中观察到175bp的特异条带；则判断待鉴定单株为具备菌核病抗性(含有抗病QTL“qC09-2”)的单株。一种鉴定油菜菌核病抗性的试剂盒，包括权利要求1所述分子标记中的SWUC797和SWUC934。本专利技术通过在抗菌核病的野生甘蓝中初步确定了抗菌核病QTL，然后对多个重要的QTL区间进行标记开发与加密，缩小QTL区间最终获得一些与抗病位点连锁度高、可用于油菜育种的标记。本专利技术的分子标记的应用可极早判断植株是否具有抗病QTL位点，去除不含抗病QTL的植株，保留含抗病QTL的植株进行成株期的茎杆抗性鉴定以及后代繁育。本专利技术可增强选择的目标性，大幅度减小后期抗性鉴定工作量，提高选择效率。附图说明图1标记SWUC797和SWUC934在抗菌核病QTL“qC09-2”中的位置展示图。说明：箭头所指为QTL“qC09-2”覆盖区域最边界的标记，下划线表示标记SWUC797和SWUC934所在位置。图2标记SWUC797和SWUC934在油菜中的扩增情况展示图。说明：箭头指示标记特异条带所在位置；泳道1～6分别代表marker、感病甘蓝、抗病甘蓝、油菜商品种“中双9号”、油菜商品种“中油821”、油菜育种系“HAUS7”；*代表扩增出标记特异条带的油菜个体。图3各种类型油菜的菌核病茎秆抗性展示。说明：CK代表油菜对照；**代表在P＝0.05水平达到显著差异。具体实施方式以下为本专利技术方法的一种具体实施方式，但并不是对本专利技术方法的限定，任何不超离本专利技术实质内容的变换，仍应属于本专利技术的保护范围。实施例1一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，通过以下方法获得：以一份感菌核病甘蓝与一份抗病甘蓝B.incana发展的F2无性系分离群体为例，详细说明获得与茎杆抗性紧密相关分子标记的方法，具体如下：(1)群体构建及表型鉴定以一份感菌核病甘蓝与一份抗病甘蓝B.incana杂交产生F1代，F1代自交种萌发后通过组培技术将每个F2基因型扩繁至20个拷贝以上，生根后种植于大田，获得149个F2代无性系。田间种植采用随机区组设计，设置2个田间重复，种植2年。茎杆菌核病抗性鉴定在开花后2周进行，采用离体茎杆室内接种法进行鉴定(参照“梅家琴等，一种植物离体茎杆接种鉴定菌核病抗性的方法，ZL201210229952.1”)，每次每个无性系鉴定3～5株，3次重复。(2)遗传连锁图谱构建与QTL扫描于苗期提取149个F2无性系幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA；用油菜通用SSR引物以及根据甘蓝参考基因组设计的SSR引物进行PCR扩增；采用JoinMap3软件构建甘蓝遗传连锁图谱；然后用WinQTL2.5Cartographer2.5软件结合图谱和表型数据，采用复合区间作图程序(CIM)扫描抗病QTL位点，最终在甘蓝C09染色体获得2个主效抗病QTL，分别命名为“qC09-1”和“qC09-2”。两个QTL表现为加性效应，分别可解释表型变异的16.7％和16.1％。(3)QTL区间标记加密利用QTL“qC09-2”的侧翼标记引物序列，在公共数据库(http://brassicadb.org/brad/index.php)中用blastn查询各QTL在甘蓝参考基因组上所对应的物理区间，将区间中的gDNA序列下载，然后各均分为30小段，将每小段序列输入primer5软件中设计一对SSR引物，QTL“qC09-2”对应物理区间共均匀设计30对SSR引物。利用F2群体的两个亲本对引物进行多态性检测，获得8个具有多态性的标记，再在“(一)”中所述的F2群体DAN中扩增这8个标记，将结果与原有分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，其包括标记SWUC797和标记SWUC934，所述SWUC797正向引物序列为GGACTTACTGCAACGGGAAA，其反向引物序列为ATTCTCTCGAACTTCGCCCT；所述SWUC934的正向引物序列为TTCACACTCCCGATCTCTCC，其反向引物序列为AGATTCCCTCCCCAACAAGT。

【技术特征摘要】
1.一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，其包括标记SWUC797和标记SWUC934，所述SWUC797正向引物序列为GGACTTACTGCAACGGGAAA，其反向引物序列为ATTCTCTCGAACTTCGCCCT；所述SWUC934的正向引物序列为TTCACACTCCCGATCTCTCC，其反向引物序列为AGATTCCCTCCCCAACAAGT。2.权利要求1所述分子标记在鉴定油菜菌核病抗性中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述分子标记鉴定油菜菌核病抗性在油菜抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅家琴，邵超国，钱伟，丁一娟，李月华，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50