一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物及其优良种质鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物及其优良种质鉴定方法，用于苦玄参优良种质的筛选与鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。本发明专利技术设计了9对核心SSR引物，并利用它们成功构建了苦玄参优良种质的特征SSR分子标记鉴定方法，可快速、准确地鉴定苦玄参优良种质。本发明专利技术基于9对SSR引物，进行PCR扩增反应，采用毛细管电泳荧光检测法，可直接根据扩增产物片段的有无和大小进行苦玄参优良种质的判断。本发明专利技术可直接应用于苦玄参优良种质的分子鉴定，具有很好的实用性。

A SSR Primer Composition for Identifying Fine Germplasm of Radix Sophorae Flavescens and Its Method for Identifying Fine Germplasm

The invention discloses an SSR primer composition for identifying the fine germplasm of Sophora flavescens and a method for identifying the fine germplasm, which is used for screening and identifying the fine germplasm of Sophora flavescens and belongs to the field of molecular identification of new plant varieties. The present invention designs 9 pairs of core SSR primers, and successfully constructs a characteristic SSR molecular marker identification method for superior germplasm of Radix Sophorae Flavescentis, which can quickly and accurately identify superior germplasm of Radix Sophorae Flavescentis. The invention is based on 9 pairs of SSR primers, carries out PCR amplification reaction, adopts capillary electrophoresis fluorescence detection method, and can directly judge the excellent germplasm of Radix Sophorae Flavescentis according to the presence and size of amplified product fragments. The invention can be directly applied to the molecular identification of the fine germplasm of Sophora flavescens, and has good practicability.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物及其优良种质鉴定方法
本专利技术公开了一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物及其优良种质鉴定方法，用于苦玄参优良种质的筛选与鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。
技术介绍
苦玄参Picriafel-tearraeLour.是玄参科苦玄参属唯一的一种植物，作为药用在广西已经有200多年的历史，是广西道地药材。其主要药理作用为消肿止痛、抗菌、消炎、镇痛等，是广西梧州制药集团生产的多种中成药如知名品牌炎肿化毒片、炎见宁片、妇炎净胶囊等，以及保健品如梧州龟令膏等的主要原料药之一。其主要化学成分为三萜类化合物、黄酮类化合物及苷类化合物几大类，而其主要药用有效成分为四环三萜苷类，其中以苦玄参苷IA和苦玄参苷IB为主，根据《中国药典》2015版规定，合格的苦玄参药材其苦玄参苷IA含量应不低于0.25％。药材有效成分的合成和积累受外界环境及种质来源的影响，其中，以DNA为表现形式的种质是决定因素。目前，由于生长环境的影响，苦玄参野生药材供不应求，其医疗和企业用药主要来源于栽培种质。但栽培种质品种混杂，质量不一，对企业用药带来阻碍，因此，筛选和鉴定优良种质对促进人工种植的发展非常必要。种质资源鉴定方法有很多，如形态特征鉴定法、孢粉超微结构鉴定法、同工酶分析法、分子标记技术等。分子标记技术以其快速准确、多态性高、直接以DNA形式表现、不受外界环境及组织类别和发育时期的影响等优越性成为目前最受青睐的鉴定方法。SSR分子标记(Simplesequencerepeats)即简单序列重复，也称微卫生标记，是近年发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。微卫生标记在原核生物和真核生物基因组中随机分布，而且该标记呈共显性，符合孟德尔遗传模式，易于操作，具有高度重复性和可靠性，显示出较强的多态性等优点，使其在遗传连锁图谱构建、遗传多样性检测、基因定位及分子标记辅助优良种质选择等领域有重要应用，因此被认为是目前最好的分子标记之一。基于SSR分子标记的诸多优点，其在基因组差异与性状变异的相关性研究、植物遗传育种等方面得到广泛的应用。然而，SSR标记在苦玄参优良种质的鉴定方面尚未见报道，故需建立一种快速、准确鉴定苦玄参优良种质的分子手段，本专利技术在一系列实验的基础上，筛选出9对SSR核心引物，可对优良种质进行快速、准确地鉴定。
技术实现思路
本专利技术目的：针对目前苦玄参优良种质鉴定技术缺乏的问题，本专利技术提出了一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物，该组合物由9对SSR引物组成，基于该组合物本专利技术构建了苦玄参优良种质的特征SSR分子标记鉴定技术。本专利技术另一目的是提供一种使用该组合物对优良种质进行鉴定的方法，基于该方法可实现对不同来源苦玄参优良种质的鉴定，可为苦玄参优良种质的筛选和培育提供快速准确的鉴定方法，具有很好的实用性。技术方案：为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物，该组合物由9对引物组成，其序列如下表所示：应用所述的苦玄参优良种质鉴定引物组合物，构建苦玄参优良种质的特征SSR分子标记鉴定方法，该方法具有下表所示的特征：依据上表，苦玄参优良种质的判读方法为：用9对引物进行PCR时，“扩增结果”栏各引物相对应的片段显示为“有”的，最少有任意6对以上引物组合其相应的片段有扩增；应用“扩增结果”栏相对应的片段显示为“无”的4对引物进行PCR时，所有显示为“无”的片段均应无扩增。一种应用所述组合物快速鉴定苦玄参优良种质的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品DNA；2)使用相同的反应体系和反应程序，应用本专利技术引物组合物对待测苦玄参样本进行PCR扩增；3)PCR产物则利用毛细管电泳荧光检测法进行检测，依据扩增产物的有无和片段大小，依据上述苦玄参优良种质的判读方法，进行苦玄参优良种质的判读，鉴定待测样品的优劣。步骤1)中，采用CTAB法完成待测样品DNA提取。步骤2)中，PCR扩增反应体系体积为20μL，包括：ddH2O14.8μL，dNTP0.4μL，Buffer2μL，F0.3μL(20μM)，R0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq0.2μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。步骤3)中，所述毛细管电泳荧光检测包括以下步骤：将甲酰胺与分子量内标按100∶1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。应用上述鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物鉴定苦玄参优良种质的方法，苦玄参为任意来源的苦玄参种质，苦玄参优良种质指苦玄参品种中苦玄参苷IA含量较高的品种。本专利技术具有以下优势：1)结果高度准确、可靠：本专利技术所用苦玄参材料来自于苦玄参主要栽培区广西梧州和龙州，抽样选择部分苦玄参株系利用本专利技术进行鉴定，鉴定结果准确、可靠。2)操作简便快速：本方法提取样本DNA后，进行PCR扩增和毛细管电泳荧光检测，即可以根据扩增片段的有无和大小判断结果，一般整个检测过程可在几小时内完成。3)取材方便、实用价值明显：本方法利用叶片进行检测，干样、鲜样均可适用，不同生育期均可取样，不受季节、地点等因素的限制。4)通过对苦玄参优良种质进行鉴定可以为苦玄参的人工种植提供优良种质，使药材质量统一，可促进苦玄参种植产业的发展，为医疗和企业提供合格药材。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的编号为lxj12的株系在6个SSR位点的扩增结果图；图中，从上至下引物编号依次为P21、P34、P45、P52、P59、P72；图2为本专利技术实施例所提供的编号为zgb04的株系在6个SSR位点的扩增结果图；图中，从上至下引物编号依次为P21、P34、P45、P52、P59、P69。具体实施方式为了更清楚详细地介绍本专利技术实施例所提供的利用SSR分子标记技术鉴定苦玄参优良种质的方法，下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1和实施例2的仪器、试剂和实施流程如下：1.仪器和试剂1)主要仪器：Bio-RadPCR扩增仪、3730XL测序仪。2)主要试剂：CTBA法DNA提取试剂盒、PCR试剂盒。2.实验流程1)提取待测样品DNA；2)引物合成：引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物表见表1。表19对引物的信息3)反应条件PCR扩增反应体系体积为20μL，包括：ddH2O14.8μL，dNTP0.4μL，Buffer2μL，F0.3μL(20μM)，R0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq0.2μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物，其特征在于由9对引物组成，其引物序列如下表所示：

【技术特征摘要】
1.一种鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物，其特征在于由9对引物组成，其引物序列如下表所示：2.应用权利要求1所述的鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物构建苦玄参优良种质的特征SSR分子标记鉴定方法，其特征在于，所获得的苦玄参优良种质的特征SSR分子标记鉴定方法具有下表所示的特征：3.根据权利要求2所述的苦玄参优良种质的特征SSR分子标记鉴定方法，其特征在于，苦玄参优良种质特征SSR分子标记鉴定方法表中，“扩增结果”栏各引物相对应的片段显示为“有”的，表明当应用该引物进行PCR时，该片段应有扩增；“扩增结果”栏各引物相对应的片段显示为“无”的，表明当应用该引物进行PCR时，该片段应无扩增。4.根据权利要求3所述的苦玄参优良种质的特征SSR分子标记鉴定方法，其特征在于，苦玄参优良种质的判读方法为：用9对引物进行PCR时，“扩增结果”栏各引物相对应的片段显示为“有”的，最少有任意6对以上引物组合其相应的片段有扩增；应用“扩增结果”栏相对应的片段显示为“无”的4对引物进行PCR时，所有显示为“无”的片段均应无扩增。5.一种应用权利要求1所述的鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物快速鉴定苦玄参优良种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品DNA；2)使用相同的反应体系和反应程序，按权利要求1表格中的引物顺序依次对待测苦玄参样本进行PCR扩增；3)PCR产物则利用毛细管电泳荧光检测法进行检测，依据扩增产物的有无和片段大小进行苦玄参优良种质的判读，根据权利要求4的方法鉴定待测样品的优劣。6.根据权利要求5所述的应用鉴定苦玄参优良种质的SSR引物组合物快速鉴定苦玄参优良种质的方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢阳姣，杨帆，吴梦丽，高慧，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：广西,45