一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物及其品种鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物及其品种鉴定方法，用于苦玄参品种的鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。本发明专利技术设计了2对核心SSR引物，并利用它们成功构建了苦玄参品种的特征SSR分子标记指纹图谱，可快速、准确地鉴定苦玄参品种。本发明专利技术基于2对SSR引物，进行PCR扩增反应，采用毛细管电泳荧光检测法，可直接根据扩增产物片段的长度进行苦玄参品种属性的判断。本发明专利技术可直接应用于苦玄参品种的分子鉴定，具有很好的实用性。

A SSR Primer Composition for Identification of Sophora flavescens Varieties and Its Variety Identification Method

The invention discloses an SSR primer composition for identification of Sophora flavescens varieties and a variety identification method thereof, which is used for identification of Sophora flavescens varieties and belongs to the field of molecular identification of new plant varieties. The invention designs two pairs of core SSR primers and successfully constructs the characteristic SSR molecular marker fingerprint of Radix Sophorae flavescens varieties by using them, which can quickly and accurately identify the varieties of Radix Sophorae flavescens. The invention is based on two pairs of SSR primers, carries out PCR amplification reaction, adopts capillary electrophoresis fluorescence detection method, and can directly judge the variety attributes of Radix Sophorae according to the length of amplified product fragments. The invention can be directly applied to the molecular identification of the varieties of Sophora flavescens, and has good practicability.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物及其品种鉴定方法
本专利技术公开了一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物及其品种鉴定方法，用于苦玄参品种的鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。
技术介绍
苦玄参Picriafel-tearraeLour.是玄参科苦玄参属唯一的一种植物，作为药用在广西已经有200多年的历史，是广西道地药材，具有清热解毒、消肿止痛等功效，主要用于感冒风热、痢疾、毒蛇咬伤、跌打损伤等。目前，由于生长环境的影响，苦玄参野生药材供不应求，其医疗和企业用药主要来源于人工种植。但人工种植的品种未经选育，品种混杂，质量很不统一，给医疗和企业用药带来阻碍，因此，筛选和鉴定优良种质，为人工栽培提供纯净的苦玄参品种非常必要。种质鉴定方法有很多，如形态特征鉴定法、孢粉超微结构鉴定法、同工酶分析法、分子标记技术等。分子标记技术以其快速准确、多态性高、直接以DNA形式表现、不受外界环境及组织类别和发育时期的影响等优越性成为目前最受青睐的鉴定方法。SSR分子标记(Simplesequencerepeats)即简单序列重复，也称微卫生标记，是近年发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。微卫星在原核生物和真核生物基因组中随机分布，而且该标记呈共显性，符合孟德尔遗传模式，易于操作，具有高度重复性和可靠性，显示出较强的多态性等优点，使其在品种鉴定上得到广泛应用。然而，目前还没有有效的鉴定苦玄参品种的分子鉴定方法，故需建立一种快速、准确鉴定苦玄参品种的分子手段，本专利技术在一系列实验的基础上，筛选出2对SSR核心引物，可对本专利技术人前期选育的4个优良品种进行快速、准确地鉴定。
技术实现思路
本专利技术目的：针对目前苦玄参品种鉴定技术缺乏的问题，本专利技术提出了一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物，该组合物由2对核心SSR引物组成，基于该组合物构建了苦玄参品种的特征指纹图谱。本专利技术另一目的是提供一种使用该组合物对苦玄参品种进行鉴定的方法，该方法可直接应用于生产，对于苦玄参品种的鉴定具有重要意义。技术方案：为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物，该组合物由2对核心引物组成，其序列信息如下表所示：应用所述的苦玄参品种鉴定的引物组合物，构建苦玄参品种二进制指纹代码，所获得的4个苦玄参品种对应的指纹代码如下表所示：品种名称指纹代码lxj12A100B00010xyj01A110B10100ytl11A100B10100zgb04A010B10010一种应用所述组合物快速、准确鉴定苦玄参品种的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品DNA；2)使用相同的反应体系和反应程序，应用本专利技术引物组合物对待测苦玄参样本进行PCR扩增；3)PCR产物则利用毛细管电泳荧光检测法进行检测，对扩增产物的有无和片段大小进行判读，对照本专利技术品种指纹代码表中各品种的指纹代码，鉴定待测样品的品种。步骤1)中，采用CTAB法完成待测样品DNA提取。步骤2)中，PCR扩增反应体系体积为20μL，包括：ddH2O14.8μL，dNTP0.4μL，Buffer2μL，F0.3μL(20μM)，R0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq0.2μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。步骤3)中，所述毛细管电泳荧光检测包括以下步骤：将甲酰胺与分子量内标按100∶1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。所述的应用苦玄参SSR引物组合物鉴定苦玄参品种的方法，苦玄参品种共有4个，分别为lxj12、xyj01、ytl11、zgb04。本专利技术具有以下优势：1)结果高度准确、可靠：本专利技术所用苦玄参材料来自于苦玄参主要栽培区广西梧州和龙州，对所测品种连续多年种植，并利用本专利技术对每年种植的品种进行鉴定，鉴定结果准确、可靠。2)操作简便快速：本方法所用SSR标记引物数量少，仅2对，且提取样本DNA后，进行PCR扩增和毛细管电泳荧光检测，即可以根据扩增片段的有无和大小判断结果，一般整个检测过程可在几小时内完成。3)取材方便、实用价值明显：本方法利用叶片进行检测，干样、鲜样均可适用，不同生育期均可取样，不受季节、地点等因素的限制。4)通过对苦玄参种苗进行品种鉴定可以避免种苗生产与销售过程中出现鱼龙混杂的现象，对于苦玄参不同品种的种苗生产与销售具有十分重要的意义。附图说明图1为应用本专利技术SSR引物组合物对本专利技术实施例所检测的品种lxj12进行PCR扩增的毛细管电泳荧光检测结果图；图中，从上至下引物编号依次为P43、P61；本图为建立品种lxj12的SSR指纹代码的依据。图2为应用本专利技术SSR引物组合物对本专利技术实施例所检测的品种xyj01进行PCR扩增的毛细管电泳荧光检测结果图；图中，从上至下引物编号依次为P43、P61；本图为建立品种xyj01的SSR指纹代码的依据。图3为应用本专利技术SSR引物组合物对本专利技术实施例所检测的品种ytl11进行PCR扩增的毛细管电泳荧光检测结果图；图中，从上至下引物编号依次为P43、P61；本图为建立品种ytl11的SSR指纹代码的依据。图4为应用本专利技术SSR引物组合物对本专利技术实施例所检测的品种zgb04进行PCR扩增的毛细管电泳荧光检测结果图；图中，从上至下引物编号依次为P43、P61；本图为建立品种zgb04的SSR指纹代码的依据。具体实施方式为了更清楚详细地介绍本专利技术实施例所提供的利用SSR分子标记技术鉴定苦玄参品种的方法，下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1和实施例2的仪器、试剂和实施流程如下：1.仪器和试剂1)主要仪器：Bio-RadPCR扩增仪、3730XL测序仪。2)主要试剂：CTBA法DNA提取试剂盒、PCR试剂盒。2.实验流程1)提取待测样品DNA；2)引物合成：引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息表见表1。表12对引物的信息3)反应条件PCR扩增反应体系体积为20μL，包括：ddH2O14.8μL，dNTP0.4μL，Buffer2μL，F0.3μL(20μM)，R0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq0.2μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。3.检测方法毛细管电泳荧光检测法：将甲酰胺与分子量内标按100∶1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物，其特征在于由2对引物组成，其引物信息如下表所示：

【技术特征摘要】
1.一种鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物，其特征在于由2对引物组成，其引物信息如下表所示：2.应用权利要求1所述的鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物构建苦玄参品种二进制指纹代码，其特征在于，所获得的4个苦玄参品种对应的指纹代码如下表所示：品种名称指纹代码lxj12A100B00010xyj01A110B10100ytl11A100B10100zgb04A010B100103.一种应用权利要求1所述的鉴定苦玄参品种的SSR引物组合物快速、准确地鉴定苦玄参品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品DNA；2)使用相同的反应体系和反应程序，应用权利要求1表格中的引物对待测苦玄参样本进行PCR扩增；3)PCR产物则利用毛细管电泳荧光检测法进行检测，对扩增产物的有无和片段大小进行判读，对照权利要求2表中各品种的指纹代码，鉴定待测样品的品种。4.根据权利要求3所述的应用SSR引物组合物快速、准确地鉴定苦玄参品种的方法，其特征在于，步骤1)中，采用CTAB法完成待测样品DNA提取。5.根据权利要求3所述的应用SSR引物组合物快速、准确地鉴定苦玄参品种的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增反应体系体积为20μL，包括：ddH2O14.8μL，dNTP0.4μL，Buffer2μL，F0.3μL(20μM)，R0.3μL(20μM)...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢阳姣，吴梦丽，杨帆，高慧，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：广西,45