一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法。在pLenti‑CMV‑Gag‑Mcherry‑Puro载体的Not I和BamH I多克隆位点处插入cytochrome C基因，用构建好的pLenti‑CMV‑cytochrome C‑Emcherry‑Puro重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，培养、出毒、收取病毒上清、过滤得重组慢病毒液。将包装好的重组慢病毒感染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选及鉴定，得稳定表达cytochrome C蛋白细胞株。本发明专利技术利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达cytochrome C蛋白的细胞株，该细胞株为研究cytochrome C蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。

Construction of a cell line stably expressing cytochrome C protein

The invention discloses a method for constructing a cell line stably expressing cytochrome C protein. The cytochrome C gene was inserted at the not I and BamH I polyclonal sites of pLenti CMV Gag Mcherry Puro vector. The constructed recombinant plasmid pLenti CMV cytochrome C Emcherry Puro was co-transfected into 293;T cells with the viral packaging plasmid, and the recombinant lentivirus solution was cultured, produced, collected and filtered. 293T cells were infected with the packaged recombinant lentivirus. Cychrome C protein was stably expressed by purinomycin screening and identification. The present invention utilizes recombinant lentivirus system to prepare a cell strain which can stably express cytochrome C protein and provides a good tool for studying the biological function of cytochrome C protein.

【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达cytochromeC蛋白细胞株的构建方法
本专利技术属于医学分子生物学领域，具体涉及一种稳定表达cytochromeC蛋白细胞株的构建方法。
技术介绍
cytochromeC是由核基因编码，位于线粒体内外膜之间，是进化上最保守的蛋白质之一，在外界凋亡刺激因素的作用下，线粒体膜通透性改变，释放cytochromeC等进入细胞浆，在dATP存在时能够与凋亡相关因子-1(Apaf-1)相结合，从而形成多聚体，并促使pro-caspase-9与其结合形成凋亡复合体，激活Caspase-9，进而通过级联反应激活下游的Caspase-3，导致细胞凋亡。可见，cytochromeC从线粒体释放到细胞浆是触发细胞凋亡信号通路的关键步骤，而细胞凋亡的紊乱又是肿瘤发生和发展的关键过程，因此，通过导入cytochromeC诱导细胞凋亡可能是肿瘤治疗的途径之一，但是外源性cytochromeC能否诱导细胞凋亡有待验证。研究表明，从健康的非凋亡的细胞中纯化的细胞色素C在无细胞体系中可以引起Caspase的活化促进细胞凋亡，细胞色素缺陷型的小鼠在胚胎期就会死亡，经cytochromeC显微注射后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)cytochrome C基因的扩增；(2)将cytochrome C基因与载体pLenti‑CMV‑Gag‑Mcherry‑Puro连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti‑CMV‑cytochrome C‑Emcherry‑Puro；(3)将重组慢病毒表达质粒pLenti‑CMV‑cytochrome C‑Emcherry‑Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV‑G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；(4)将包装好的重组慢病毒CMV‑mch...

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达cytochromeC蛋白细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)cytochromeC基因的扩增；(2)将cytochromeC基因与载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochromeC-Emcherry-Puro；(3)将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochromeC-Emcherry-Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；(4)将包装好的重组慢病毒CMV-mcherry-LVP转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定，获得稳定表达cytochromeC蛋白细胞株。2.根据权利要求1所述一种稳定表达cytochromeC蛋白细...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭建军，田莹，檀军，赵帅，张书琪，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52