近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法技术

本发明专利技术公开了近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法。所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的酸性蛋白酶的酶活可达176.9U/mL，比酶活达1478.3U/mg，远高于现有的假丝酵母酸性蛋白酶；其水解效果也优于商业木瓜蛋白酶及酸性蛋白酶。本发明专利技术还提供了所述酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法，首次在毕赤酵母上成功表达纯化了近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，大幅度提高了SAPP1蛋白酶的产量，产量可高达312.5mg/L发酵液，具有广阔的推广应用价值。

Near-smooth Candida acidic protease SAPP1 and its expression and purification

The present invention discloses near smooth Candida acidic protease SAPP1 and its expression and purification method. The amino acid sequence of the near-smooth acidic protease SAPP 1 of Candida spp. as shown in SEQ ID NO.1, the activity of the acidic protease can reach 176.9U/mL, and the specific activity is 1478.3U/mg, which is much higher than that of the existing acidic protease of Candida spp. and its hydrolysis effect is also better than that of commercial papain and acidic protease. The invention also provides the acid protease SAPP1 and its expression and purification method. The near-smooth acid protease SAPP1 was successfully expressed and purified on Pichia pastoris for the first time, and the production of SAPP1 protease was greatly increased. The production of SAPP1 protease can reach 312.5 mg/L fermentation broth, which has broad application value.

【技术实现步骤摘要】
近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法
本专利技术属于生物工程
，特别涉及近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1及表达、纯化方法。
技术介绍
假丝酵母菌是世界上8％～10％医院获得性血流感染的致病因子，白假丝酵母是最常见的，但其他物种(如近平滑假丝酵母Candidaparapsilosis)的感染频率也在增加。近平滑假丝酵母是拉丁美洲第二最常见的假丝酵母，在1岁以下的儿童中尤其流行。近平滑假丝酵母也是欧洲常见的感染源。近平滑假丝酵母的发病机制与使用留置医疗器械和高糖饲料有关，已经成为败血症和免疫受损患者伤口和组织感染的一个重要原因。这一物种经常被发现存在于医护人员手中，并且已经导致了几起暴发感染。与白色假丝酵母菌和热带假丝酵母菌不同，近平滑假丝酵母不是一种专性的人类病原体，它是从非人类来源如家畜、昆虫或土壤中分离出来的。近平滑假丝酵母也是一种正常的人类共生菌，是最常分离的真菌之一。免疫功能低下的个体和外科手术患者，尤其是那些胃肠道手术的患者，感染近平滑假丝酵母的风险很高。目前对于治疗由C.parapsilosis引起的侵袭性念珠菌病尚无共识，对其感染机制也没有非常清晰的研究，通常认为其分泌的酸性蛋白酶在破坏宿主角质层、水解基质和蛋白质中起重要作用。目前的研究中主要集中在白色假丝酵母上，对近平滑假丝酵母的研究极少，重组表达并纯化假丝酵母分泌酸性蛋白酶几乎没有，其酸性蛋白酶的表达纯化对研究假丝酵母感染机制及寻找潜在治疗方法具有重要意义。另一方面，近平滑假丝酵母也是一种重要的工程菌。魏文婷等利用近平滑假丝酵母作为生产甘露醇的工程菌；谢鑫磊等利用近平滑假丝酵母作为生产油脂的工程菌；李亚莉等以晒青茶为原料，接种近平滑假丝酵母发酵普洱茶生产GABA；许敏伟利用近平滑假丝酵母作为立体异构生产(S)-PED的反应介质。近平滑假丝酵母来源的酸性蛋白酶在营养和致病方面都有重要功能，而且在酸性条件下具有高活性和高稳定性的蛋白酶，具有重大的工业应用前景。目前重组表达假丝酵母酸性蛋白酶的产量较低，如ZuzanaVinterová等在酿酒酵母里表达近平滑假丝酵母SAPP1的产量为3mg/L；E.Hochuli等在大肠杆菌表达SAP2的酶活为2.3U/mg；JingLi等在大肠杆菌表达SAP6的酶活为19.6U/mg。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，该酸性蛋白酶属于A1家族，发酵液蛋白酶活为176.9U/mL，比酶活为1478.3U/mg，高于同类报道的酸性蛋白酶酶活。本专利技术的另一目的在于提供所述的酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法。本专利技术以近平滑假丝酵母为来源，采用了基因工程的技术方法，从中获得酸性蛋白酶基因SAPP1，构建重组质粒，然后在毕赤酵母中重组表达，通过亲和层析对发酵液中的酸性蛋白酶组分进行纯化，首次在毕赤酵母中成功表达纯化了近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1。本专利技术的再一目的在于提供一种重组表达载体、重组工程细胞。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的核苷酸序列优选如SEQIDNO.2所示。所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，包括如下步骤：(1)构建含有所述的酸性蛋白酶基因片段SAPP1的重组表达载体；(2)将所述的重组表达载体转化细胞；(3)对阳性细胞进行发酵诱导及纯化。步骤(1)中所述的表达载体优选为表达载体pICh，该表达载体通过将表达载体pPIC9K启动子改造为dl+2x201AOXl，其核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；优化α-factor信号肽编码序列如SEQIDNo.6所示，去除载体pPIC9K当中3个PstI和1个XhoI，突变Amp抗性基因7068T>G，删除了Kan抗性片段，并将多酶切位点改造替换为EcoRI,BamHI,MluI,XhoI,PstI,ApaI得到。所述的酸性蛋白酶基因片段SAPP1与表达载体pICh片段优选按摩尔比为1：5进行连接。步骤(1)中所述的酸性蛋白酶基因片段SAPP1优选通过提取近平滑假丝酵母总RNA，反转录得到近平滑假丝酵母cDNA，再以所述的近平滑假丝酵母cDNA为模板，设计特异性引物通过PCR扩增得到。所述的特异性引物优选为正向引物F(5’-GTCAGGATCCATTCCAGAGGAGGCTGCTAA-3’)和反向引物R(5’-ATGCCTGCAGAACGGCAGAAATGCTCGA-3’)，下划线序列分别表示BamHI酶切位点和PstI酶切位点。所述的近平滑假丝酵母优选为近平滑假丝酵母GIM2.146。所述的近平滑假丝酵母优选培养于YPD固体培养基中，30℃培养2天。所述的YPD固体培养基的配方优选为葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母提取物1g，琼脂粉1g。步骤(2)中所述的细胞优选为毕赤酵母GS115。步骤(2)中所述的转化优选为将所述的重组表达载体线性化后通过电转化法转入细胞。所述的线性化的操作优选为用SalI内切酶酶切所述的重组表达载体。步骤(2)中所述的将所述的重组表达载体转化细胞的具体步骤进一步优选为：①构建并提取pMD18-T-SAPP1克隆载体质粒，以之为模板进行PCR扩增，鉴定产物后用纯化回收，得到回收产物；②把表达载体pPIC9K启动子改造为dl+2x201AOXl，其核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；优化α-factor信号肽编码序列如SEQIDNo.6所示，去除载体pPIC9K当中3个PstI和1个XhoI，突变Amp抗性基因7068T>G，删除了Kan抗性片段，并将多酶切位点改造替换为EcoRI,BamHI,MluI,XhoI,PstI,ApaI，构建得到表达载体pICh；③使用BamHI和PstI对步骤①的回收产物和步骤②得到的pICh载体进行双酶切后，分别纯化回收，得到双酶切后的蛋白酶基因片段和pICh载体；④将步骤③中得到的蛋白酶基因片段和pICh载体进行体外连接，构建得到表达质粒pICh-SAPP1；⑤对表达质粒pICh-SAPP1，用SalI内切酶酶切，将表达质粒载体线性化；⑥制备毕赤酵母GS115感受态；使用电转化法把步骤⑤得到的线性化质粒转入毕赤酵母中。步骤①中所述的鉴定优选为通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。步骤①中所述的构建pMD18-T-SAPP1克隆载体质粒的具体操作为：将酸性蛋白酶基因片段SAPP1与pMD18-T载体连接，T载体连接体系如下：pMD18-T为0.5μL、SAPP1为4.5μL、SolutionI为5μL。步骤④中所述的蛋白酶基因片段和pICh载体优选按摩尔比为1：5配比进行体外连接。步骤(3)中所述的纯化优选为使用镍柱亲和层析纯化目的蛋白；所述的镍柱亲和层析所用洗脱液优选为0.15M咪唑、0.5MNaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH7.4)。步骤(3)中所述的发酵诱导的条件优选为在BMMY培养液中，28℃，250rpm振荡培养，每24小时添加1.5％的甲醇溶液进行诱导表达；诱导的时间优选为7天。所述的BMMY培养液的配方优选为酵母提取物10g，胰蛋白胨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1，其特征在于：编码所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1或2所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建含有所述的酸性蛋白酶基因片段SAPP1的重组表达载体；(2)将所述的重组表达载体转化细胞；(3)对阳性细胞进行发酵诱导及纯化。4.根据权利要求3所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的表达载体为表达载体pICh，该表达载体通过将表达载体pPIC9K启动子改造为dl+2x201AOXl，其核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；优化α-factor信号肽编码序列如SEQIDNo.6所示，去除载体pPIC9K当中3个PstI和1个XhoI，突变Amp抗性基因7068T>G，删除了Kan抗性片段，并将多酶切位点改造替换为EcoRI,BamHI,MluI,XhoI,PstI,ApaI得到。5.根据权利要求3所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于：所述的酸性蛋白酶基因片段SAPP1与表达载体pICh片段按摩尔比为1：5进行连接；所述的近平滑假丝酵母为近平滑假丝酵母GIM2.146；步骤(2)中所述的转化为将所述的重组表达载体线性化后通过电转化法转入细胞。6.根据权利要求5所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的细胞为毕赤酵母GS115；所述的线性化的操作为用SalI内切酶酶切所述的重组表达载体。7.根据权利要求3所述的近平滑假丝酵母酸性蛋白酶SAPP1的异源表达及纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述的将所述的重组表达载体转...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗晓春，邓俊劲，李志伟，史丹，茅和花，梁爽，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44