本发明专利技术公开了一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制；(2)样品处理；(3)标准曲线制作；(4)定量分析：取试验样品按照步骤(2)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛及其活性代谢产物的浓度。本发明专利技术应用高效液相色谱技术(HPLC)测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物的浓度，准确定量人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物的浓度，通过色谱柱、前处理方法、流动相、质谱条件等的合理选择，流速、流动相比例、色谱条件等实验条件的优化，经过系列方法学验证，使得整个定量检测方法切实可行，操作简便，重复性高，准确性好，可操作性强，可以直接运用于临床患者血浆样品检测分析及相关药代动力学分析。
【技术实现步骤摘要】
一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法
本专利技术涉及一种应用高效液相色谱技术(HPLC)进行人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，可用于临床药物浓度监测。本专利技术属于药物分析
技术介绍
替格瑞洛，又名倍林达，是一种新型、口服、可逆的血小板腺苷二磷酸(ADP)P2Y受体拮抗剂，为非前体药物，无须经肝代谢激活，直接作用于P2Y12受体，同时，替格瑞洛吸收后可快速生成活性代谢产物AR-C124910XX，替格瑞洛本身及其代谢产物均有活性，且药物本身活性较其代谢产物活性更强，因此，可快速强效地抑制ADP介导的血小板聚集。替格瑞洛作为一种血小板抑制剂，广泛用于急性冠脉综合征患者，包括接受药物治疗和经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的患者，降低血栓性心血管事件的发生率。目前，多国指南优先推荐替格瑞洛的剂量为：负荷量180mg，维持量90mg，一日两次，口服。而上述指南的数据多来源于外国人群而非中国人，因此其推荐剂量是否适合中国人有待确证。越来越多的研究表明，在亚洲人群中，较低的给药剂量(如，负荷量90mg，维持量90mg，一日一次，口服；维持量60mg，一日两次，口服；维持量45mg，一日两次，口服)可达到与推荐剂量相同的抗血小板聚集效果。对替格瑞洛进行药物浓度监测能够更好的监测治疗效果及不良反应，为临床的个体化治疗提供依据。目前，综合分析检索到的国内外有关文献，对生物样本中替格瑞洛浓度的测定方法有HPLC-MS/MS法，尽管该方法有灵敏度好，特异性好等优点，但仪器设备价格昂贵实验室覆盖率较小，不利于推广。故，本专利技术首次提出了一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法及其配套试剂盒，使用本专利技术的检测方法及其配套试剂盒具有操作简单，专属性好，准确度高，易于推广等优点，可同时测定其原型药物及活性代谢产物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法及其配套试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的；本专利技术的一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：精密称取替格瑞洛及AR-C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液及1000μg/mL的AR-C124910XX储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；精密称取伏立康唑，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为50μg/mL的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在4℃下保存，备用；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛工作溶液和AR-C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛校正标样的梯度浓度范围为50～1000ng/mL，AR-C124910XX校正标样的梯度浓度范围为20～500ng/mL；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛质控溶液和AR-C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛质控样品的梯度浓度为：80、300、800ng/mL，AR-C124910XX质控样品的梯度浓度范围为40、150、400ng/mL；(2)样品处理：分别取等体积的校正标样、质控样品、待测样品、空白人正常血浆，分别向校正标样、质控样品、待测样品中加入内标工作溶液，空白人正常血浆中加入等体积水；向上述每个混合液中分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，通过0.22μm滤膜过滤，得到提取物，待测；(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正标样、质控样品的提取物进行HPLC分析测定，分别以替格瑞洛、AR-C124910XX和内标的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度为横坐标制作标准曲线；(4)定量分析：取待测样品按照步骤(2)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度。其中，优选的，步骤(3)中HPLC分析测定血浆样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度，测定条件如下：检测器：赛诺菲ThermoUltimate3000；色谱柱：菲罗门SynergiTMPolar-RPphenyl(150x4.6mm,4μm)；流动相A：乙腈；流动相B：水；等度洗脱，洗脱程序为：A：B＝42：58；柱温：40℃；检测波长：300nm；流速：1.0mL/min；进样量：40μL。其中，优选的，步骤(4)中结果计算具体为：按公式(1)计算样品中替格瑞洛的浓度；按公式(2)计算样品中AR-C124910XX的浓度；Y＝0.0063X+0.0819(1)Y＝0.0128X+0.0481(2)式中：Y：待测物与内标物质的峰面积之比；X：待测物的浓度，单位为ng/mL。进一步的，本专利技术还提出了一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测试剂盒，所述的试剂盒中含有以下成分：(1)梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液精密称取替格瑞洛，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液；(2)梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液精密称取AR-C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为1000μg/mL的AR-Cl24910XX储备液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；(3)梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液；(4)梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；(5)梯度浓度范围为50～1000ng/mL的替格瑞洛校正标样取空白人正常血浆，加入所述的替格瑞洛工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛梯度浓度范本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：精密称取替格瑞洛及其活性代谢产物AR‑C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液及1000μg/mL的AR‑C124910XX储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液，将AR‑C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR‑C124910XX工作溶液；将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液，将AR‑C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR‑C124910XX质控溶液；精密称取伏立康唑，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为50μg/mL的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在4℃下保存，备用；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛工作溶液和AR‑C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛校正标样的梯度浓度范围为50～1000ng/mL，AR‑C124910XX校正标样的梯度浓度范围为20～500ng/mL；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛质控溶液和AR‑C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛质控样品的梯度浓度为：80、300、800ng/mL，AR‑C124910XX质控样品的梯度浓度范围为40、150、400ng/mL；(2)样品处理：分别取等体积的校正标样、质控样品、待测样品、空白人正常血浆，分别向校正标样、质控样品、待测样品中加入内标工作溶液，空白人正常血浆中加入等体积水；向上述每个混合液中分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，通过0.22μm滤膜过滤，得到提取物，待测；(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正标样、质控样品的提取物进行HPLC分析测定，分别以替格瑞洛、AR‑C124910XX和内标的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中替格瑞洛、AR‑C124910XX的浓度为横坐标制作标准曲线；(4)定量分析：取待测样品按照步骤(2)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛、AR‑C124910XX的浓度。...
【技术特征摘要】
1.一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：精密称取替格瑞洛及其活性代谢产物AR-C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液及1000μg/mL的AR-C124910XX储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；精密称取伏立康唑，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为50μg/mL的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在4℃下保存，备用；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛工作溶液和AR-C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛校正标样的梯度浓度范围为50～1000ng/mL，AR-C124910XX校正标样的梯度浓度范围为20～500ng/mL；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛质控溶液和AR-C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛质控样品的梯度浓度为：80、300、800ng/mL，AR-C124910XX质控样品的梯度浓度范围为40、150、400ng/mL；(2)样品处理：分别取等体积的校正标样、质控样品、待测样品、空白人正常血浆，分别向校正标样、质控样品、待测样品中加入内标工作溶液，空白人正常血浆中加入等体积水；向上述每个混合液中分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，通过0.22μm滤膜过滤，得到提取物，待测；(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正标样、质控样品的提取物进行HPLC分析测定，分别以替格瑞洛、AR-C124910XX和内标的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度为横坐标制作标准曲线；(4)定量分析：取待测样品按照步骤(2)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中HPLC分析测定血浆样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度，测定条件如下：检测器：赛诺菲ThermoUltimate3000；色谱柱：菲罗门SynergiTMPolar-RPphenyl(150x4.6mm,4μm)；流动相A：乙腈；流动相B：水；等度洗脱，洗脱程序为：A：B＝42：58；柱温：40℃；检测波长：300nm；流速：1.0mL/min；进样量：40μL。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中结果计算具体为：按公式(1)计算样品中替格瑞洛的浓度；按公式(2)计算样品中AR-C124910XX的浓度；Y＝0.0063X+0.0819(1)Y＝0.0128X+0.0481(2)式中：Y：待测物与内标物质的峰面积之比；X：待测物的浓度，单位为ng/mL。4.一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有以下成分：(1)梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液精密称取替格瑞洛，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱钊，海鑫，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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