一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法及其用途技术

本发明专利技术属于中药材成分检测领域，具体涉及一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法及其用途。该方法包括：供试品溶液制备；混合对照品溶液制备；HPLC测定：将供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，供试品溶液进样量0.5‑2.5μL。该方法通过控制进样量克服了尿苷用有机溶剂提取分析时出现的峰塌陷、峰形不对称等问题，实现对尿苷和麦角甾醇的同时检测，同时该检测方法稳定、可靠，应用范围广。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法及其用途
本专利技术属于中药材成分检测领域，具体涉及一种同时检测尿苷和麦角甾醇成分的方法。
技术介绍
随着药用真菌的种类不断增加，我国已成为名副其实的食药用菌大国。食药用菌因含有多糖、多肽氨基酸、甾体、核苷、生物碱、三萜、矿物质、维生素等多种活性成分而具有重要的药用价值。迄今为止，食药用菌活性成分的研究主要集中于多糖、三萜、核苷和甾体类化合物的单一类成分研究，同时研究多类活性成分的报道还相对较少。目前，已有研究通过高效液相色谱法同时测定冬虫夏草中的核苷和麦角甾醇，但其报道的样品制备方法繁琐复杂、影响因素较多，不利于实际推广和应用。文献《加压溶剂提取-高效液相色谱法测定天然和人工虫草中的麦角甾醇、核苷及其碱基》中同时能够检测到虫草中的麦角甾醇和尿苷，但以甲醇为提取溶剂，提取温度160℃，还需加压提取，总体提取的条件较苛刻。暗褐网柄牛肝菌是一种具有药用开发价值的食用真菌，经常食用可增强机体免疫力、改善机体微循环，因此，其子实体中活性成分的研究对其日后的开发应用有着重要意义。现市售的暗褐网柄牛肝菌有人工、半人工与野生三种，不同生长环境和真菌对其质量影响较大，无法保证其用药的安全性和有效性。目前已有文献报道绒柄牛肝菌HPLC指纹图谱分析的方法，文献《绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究》中绒柄牛肝菌甲醇有效部位的RP-HPLC指纹图谱可检出11个相对稳定的色谱峰，但没有对峰进行成分归属。药用真菌中尿苷作为主要成分之一，在HPLC检测中因其极性较大，核苷类成分的峰较高较多且容易将尿苷峰包埋在其中，在同时检测小极性甾醇类成分和大极性核苷类成分时，对尿苷进行与其他核苷类成分的有效分离及检测难度大。目前尚未有暗褐网柄牛肝菌分析方法的相关报道，需建立能同时有效鉴别分离暗褐网柄牛肝菌的尿苷和麦角甾醇的方法，为暗褐网柄牛肝菌及其他食药用菌的成分分析提供参考。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法，该方法通过控制进样量克服了尿苷用有机溶剂提取分析时出现的峰塌陷、峰形不对称等问题，实现了HPLC图谱中各成分峰有效分离。本专利技术的方法灵敏、快捷、应用范围广。一方面，本专利技术提供一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法，包括步骤：将供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用WatersHSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B)，流速1mL/min，供试品溶液进样量0.5-2.5μL。在一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为0.5μL。在另一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为1μL。在另一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为2μL。在另一些实施方案中，所述供试品溶液进样量为2.5μL。在一些实施方案中，所述色谱柱柱温为30℃。在一些实施方案中，所述高效液相色谱检测波长为250-270nm。在一些实施方案中，所述高效液相色谱检测波长为260nm。在一些实施方案中，本专利技术所述的同时检测核尿苷和麦角甾醇成分的方法，还包括步骤：供试品溶液制备：往样品粉末中加入甲醇进行提取，过滤，取滤液即得。在一些实施方案中，本专利技术所述的同时检测尿苷和麦角甾醇成分的方法，还包括步骤：混合对照品溶液制备：取尿苷、麦角甾醇，用甲醇溶解后得混合对照品溶液。在一些实施方案中，所述混合对照品溶液为尿苷浓度0.340mg/mL和麦角甾醇浓度0.408mg/mL的混合对照品甲醇溶液。在一些实施方案中，所述样品粉末加入甲醇的料液比为1g/10mL或1g/20mL。在一些实施方案中，所述样品粉末加入甲醇，所用的样品粉末为0.5g，甲醇为5mL。在一些实施方案中，所述提取为超声提取，超声提取时间为0.5h-1h。在一些实施方案中，所述过滤用0.45μm有机滤膜进行。在一些实施方案中，所述超声提取时间为0.5h。另一方面，本专利技术提供了使用本专利技术所述的方法在鉴定尿苷或麦角甾醇中的用途。另一方面，本专利技术提供了使用本专利技术所述的方法在检测食药用菌中尿苷或麦角甾醇成分中的用途。在一些实施方案中，其中所述的食药用菌为牛肝菌、冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌或松茸。在一些实施方案中，其中所述的食药用菌为暗褐网柄牛肝菌。本专利技术所述的“食药用菌”包括具备医药用途的大型真菌，包括但不限于冬虫夏草、蝉花、灵芝、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、云芝、牛肝菌、蛹虫草、羊肚菌或松茸等，它们不仅是传统的益气、强身、祛病、通经、益寿等功能，还具增强人体免疫力，抗肿瘤抗癌的功效。在一些实施方案中，本专利技术的食药用菌包括但不限于牛肝菌、冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌或松茸等。本专利技术用到的简写词表示如下含义：h小时；mg毫克；mL毫升；g克；μL微升；min分钟。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术提供的一种同时检测食药用菌中核苷类和甾醇类成分的方法，通过HPLC检测中控制进样量、控制洗脱梯度克服了尿苷用有机溶剂提取分析时出现的峰塌陷、峰形不对称等问题，该方法稳定、可靠，实现尿苷峰从核苷成分峰中有效分离，同时将极性小的麦角甾醇分离，HPLC图谱中各成分峰清晰，无基线漂移、无峰塌陷、无峰形不对称等问题。为今后暗褐网柄牛肝菌及其相关产品的开发应用和质量监控提供依据。2、本专利技术提供的方法检测应用范围广泛，除了能够检测暗褐网柄牛肝菌成分外，还可以检测冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌、松茸等等其他真菌类中药材成分。附图说明以下，结合附图来详细说明本专利技术的实施方式，其中，1和2分别代表尿苷峰和麦角甾醇峰：图1～图3分别为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液HPLC检测中梯度洗脱1、梯度洗脱2和梯度洗脱3条件下的HPLC图谱，V01～V03分别代表样品进样量为5μL、10μL和20μL条件下的HPLC图谱，R0为混合对照品进样量为5μL条件下的HPLC图谱；图4为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液HPLC检测中不同进样量条件的HPLC图谱，R代表混合对照品0.5μL进样量条件下的HPLC图谱；V1～V6分别代表样品进样量为0.25μL、0.5μL、1μL、2μL、2.5μL和3μL条件下的HPLC图谱；图5为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液HPLC检测中进样量考察时进样量0.5μL条件下的HPLC图谱；图6为暗褐网柄牛肝菌供试品溶液制备过程中不同提取溶剂条件下的HPLC图谱，R代表混合对照品的HPLC图谱；S1a～S5a分别代表样品提取溶剂为：超纯水、50％甲醇、无水甲醇、水复溶和50％甲醇复溶条件下的HPLC图谱；图7为冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌和松茸供试品溶液按实施例3的HPLC色谱条件测定条件下的HPLC图谱，R代表混合对照品的HPLC图谱；S1c～S4c分别代表冬虫夏草、蛹虫草、六妹羊肚菌和松茸的HPLC图谱。具体实施方式以下所述的是本专利技术的优选实施方式，本专利技术所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此专利技术创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本专利技术的保护范围。实施例中所用的原料、仪器均可以通过商业途径获得。1.药材来源2.实验仪器Agilent1260型高效液相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法，包括步骤：将供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用Waters HSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)‑甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B)，流速1mL/min，供试品溶液进样量0.5‑2.5μL。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法，包括步骤：将供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱检测，HPLC色谱条件为：采用WatersHSST3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，0％B；5～15min，0％→4％B；15～45min，4％→100％B；45～60min，100％B)，流速1mL/min，供试品溶液进样量0.5-2.5μL。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述供试品溶液进样量为0.5μL、1μL、2μL或2.5μL。3.根据权利要求1所述的同时检测尿苷和麦角甾醇成分的方法，还包括步骤：供试品溶液制备：往样品粉末中加入甲醇进行提取，过滤，取滤液即得。4.根据权利要求1所述的同时检测尿苷和麦角...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱正明，黄琦，李春红，谢美霞，朱志钢，丰其娥，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，乳源南岭好山好水冬虫夏草有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44