高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用制造技术

高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用，本发明专利技术属于分子遗传育种技术领域，涉及一种利用高通量SNP分子标记检测高油酸花生AhFAD2B基因分型的专用引物组合及其应用。所述引物组为检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物组，包括：带有标签A的野生型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；带有标签B的突变型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；AhFAD2B基因通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术针对高油酸花生AhFAD2B新型突变814C>T等位变异设计了高通量KASP分子标记基因分型的特异引物，可以有效鉴别该AhFAD2B新型突变体，解决了现有技术的鉴别方法只能鉴别AhFAD2B经典F435突变位点448G>A等位变异的问题。

【技术实现步骤摘要】
高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用
本专利技术属于分子遗传育种
，涉及一种利用高通量SNP分子标记检测高油酸花生AhFAD2B基因分型的专用引物组合及其应用。
技术介绍
花生是重要的食用植物油和蛋白质来源，油酸含量是影响花生油及花生加工制品理化稳定性和营养价值的重要品质指标。油酸属于单不饱和脂肪酸，油酸分子中仅含有一个双价不饱和键，与含有两个或者多个双价不饱和键的多不饱和脂肪酸(如亚油酸等)相比，油酸的化学稳定性更强，高油酸花生制品不易氧化酸败，货架期长，高油酸花生油比普通油酸含量花生油的贮藏期能延长14倍以上，高油酸花生烘焙产品的储存期是普通油酸含量花生烘焙产品储存期的8倍以上。与亚油酸相比，油酸可以在降低人体中低密度脂蛋白胆固醇含量的同时，维持高密度脂蛋白胆固醇的含量，从而保证人体对有益胆固醇的需求又不至于提高有害胆固醇的浓度，因此油酸对人体营养健康也十分有利。目前及今后一段时期内，发掘、创新高油酸花生种质资源和培育高油酸花生新品种将是花生品质遗传改良、实现花生主推品种高油酸化的重要基础性研究工作。已有的植物脂肪酸合成代谢分子生物学研究表明，Δ12脂肪酸脱氢酶基因(FAD2)是负责将油酸(C18:1)第12碳位上的氢键催化去饱和转化为含有2个不饱和键的亚油酸(C18:2)的关键基因。因为油酸通常以油酸-CoA、油酸-PLA、油酸-PC、油酸-DAG和油酸-TAG等形式参与油酸代谢，是多种脂肪酸的前体，所以FAD2基因的表达水平对合成脂肪酸的类型及数量起着重要作用。花生中位于基因组A09、B09染色体上的两对同源非等位基因AhFAD2A和AhFAD2B的表达及酶活性对种子油酸含量具有重要影响。前人研究指出，AhFAD2A和AhFAD2B两个基因对花生的油酸含量和亚油酸含量均有贡献，只有两个基因转录受抑制或编码酶活性降低，花生才表现出高油酸性状。当前，国内外育成的高油酸花生品种和创制的高油酸花生种质大多是以二十世纪80年代美国科学家鉴定筛选的油酸含量80％(亚油酸2％)的自然突变体F435为高油酸基因供体亲本进行杂交培育而来的。对F435及其衍生系的高油酸性状遗传分析和AhFAD2A、AhFAD2B基因分型发现，高油酸花生油酸表型受两对隐性基因控制，高油酸花生中AhFAD2A基因编码区448bp位点发现1个核苷酸突变448G>A，编码的氨基酸由天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)，使得AhFAD2A编码酶活性大大降低；同时在AhFAD2B基因编码区442bp位点处有1个碱基A插入(442insA)，造成移码突变，导致编码的蛋白序列提前终止。因此，一般普遍认为花生高油酸性状的形成是AhFAD2A和AhFAD2B基因同时发生突变的结果。截至目前，我国培育的高油酸花生品种中AhFAD2A和AhFAD2B的基因类型基本为F435型，造成育成的高油酸花生品种遗传多样性低，高油酸基因类型过于单一。高油酸花生种质资源稀少已经严重阻碍了高油酸花生育种的进程。在栽培花生中，AhFAD2A普遍存在2个等位基因突变型，即AhFAD2A-G448A突变型和野生型，而AhFAD2B基因比较保守，自然突变的有利变异几率较小，但AhFAD2B基因对提高花生油酸含量可能具有更重要的影响。我们通过对大量种质资源油酸含量性状和基因型筛选后，发掘出1个不同于以往的新型高油酸花生突变体C814T(中国作物学会油料作物专业委员会第八次会员代表大会暨学术年会综述与摘要集)，其AhFAD2A基因类型与F435一致，但其AhFAD2B基因类型有别于F435的AhFAD2B基因类型，C814T的AhFAD2B基因开放读码框区自5’端核苷酸序列第442位并没有碱基A插入，而是在第814位出现C>T的碱基替换，使编码蛋白序列的第272位氨基酸由组氨酸(H)变为酪氨酸(Y)，最终也产生高油酸表型，推测AhFAD2B-814可能是高油酸性状的关键位点。所以，C814T作为一种新的高油酸花生种质资源，在培育和研究不同类型高油酸花生品种以及品质特性方面具有重要意义。花生高油酸相关的两个基因都是隐性突变基因，采用传统的杂交、回交、表型选择进行高油酸育种的周期长、成本高。然而，分子标记辅助育种可以从基因型上筛选高油酸表型，极大地提高育种效率。但是，传统的连锁标记主要是基于基因连锁的分子标记进行基因型鉴定，不能用来准确鉴定目标性状有利基因单倍型组合以及进行定向的改良育种，而且操作复杂、通量小、成本高。油酸合成基因的克隆，使得通过目标基因AhFAD2A和AhFAD2B关键突变位点开发功能性分子标记来进行育种材料的有利等位基因变异鉴定成为可能。针对F435型高油酸花生AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP和插入/缺失(InDel)等位差异，近年来开发了多种用于检测的标记和检测方法，如CAPS法(酶切扩增多态性序列法)、AS-PCR法(等位基因特异PCR法)、测序法、qRT-PCR法(荧光定量PCR法)和TaqMan探针法(申请号：201510051695.0，公开号CN104593510A)等，实现了对F435型高油酸花生育种进行分子标记辅助选择。然而，AhFAD2B-814突变基因的共显性标记还未见报道。另一方面，目前在AhFAD2B-814突变基因育种应用过程中，一般采用传统杂交和回交选择，这就需要在大规模的杂交或回交育种群体中进行准确、高效的基因型鉴定和选择。上述基于SNP和InDel标记的检测技术除了TaqMan探针法外，其他几种标记技术均难以通过1个PCR反应鉴别等位变异位点的杂合与纯合，且皆存在通量小、成本高等缺陷，无法实现高通量检测，使其在分子标记辅助选择应用中具有局限性。TaqMan探针检测技术虽然可以实现样品的高通量检测，但是由于该方法荧光标记的探针为基因特异性探针，成本相对较高。近年来，KASP基因分型技术在多种作物SNP和InDel的分子标记检测中得到广泛应用。该技术是一种独特的竞争性等位基因特异性PCR技术，它将高通量荧光检测与等位特异性PCR相结合，通过引物末端碱基的特异性匹配来对SNP以及InDel位点进行高精度的双等位基因分型。KASP检测通过一次PCR反应就可鉴别样品的基因型，能达到高通量的要求，提高检测效率；KASP使用通用荧光探针，又使检测成本大大降低。目前对于AhFAD2B-814突变基因的KASP高通量分型技术仍为空白。因此，开发基于AhFAD2B-814突变基因的KASP检测引物和检测技术，可以提高新型高油酸突变基因的应用水平，丰富高油酸花生种质资源，加速高油酸花生新品种培育进程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一套基于KASP检测技术的用于花生高油酸基因AhFAD2B分型的引物组合及其应用。针对高油酸花生新型突变基因AhFAD2B-814，提供一种高通量检测AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物及检测方法，该方法具有检测通量高、检测时间短、检测成本低、分型结果准确率高等特点，为高油酸花生分子标记辅助选择提供了新的高效技术手段。一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，所述引物组为检测高油酸花生C814T中AhFAD2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，所述引物组为检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物组，包括：带有标签序列A的野生型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；带有标签序列B的突变型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；AhFAD2B基因通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，所述引物组为检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物组，包括：带有标签序列A的野生型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；带有标签序列B的突变型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；AhFAD2B基因通用引物，核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。2.根据权利要求1所述的一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，所述带有标签序列A的野生型AhFAD2B基因特异引物，标签序列A为SEQIDNo.1所示核苷酸序列的第1-21位，该标签序列A的核苷酸序列与5’端标记了FAM荧光基团的通用荧光探针A的核苷酸序列一致；该野生型AhFAD2B基因特异引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的第22-46位单链DNA，是野生型AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第813-837位碱基的反向互补序列。3.根据权利要求1所述的一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，所述带有标签序列B的突变型AhFAD2B基因特异引物，标签序列B为SEQIDNo.2所示核苷酸序列的第1-21位，该标签序列B的核苷酸序列与5’端标记了HEX荧光基团的通用荧光探针B的核苷酸序列一致；该突变型AhFAD2B基因特异引物的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的第22-45位单链DNA，是突变型...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈四龙，刘义杰，李玉荣，程增书，王瑾，宋亚辉，张朋娟，
申请(专利权)人：河北省农林科学院粮油作物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13