本发明专利技术提供了硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用，属于SSR分子标记技术领域。硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1～58所示的29对引物。所述29对引物经过试验验证能扩增出清晰稳定条带。经过微卫星开发试验挑选出了240个阳性克隆并进行测序，其中180个(75.0％)克隆含有微卫星序列；根据引物设计的原则，共设计并合成了102对引物。根据PCR扩增及筛选，共有29对引物成功扩增出清晰稳定的条带。本发明专利技术提供的引物组能大大丰富硬叶兜兰遗传研究的手段，为将来对硬叶兜兰进行进一步的遗传分析和品种鉴定的研究提供技术基础。
【技术实现步骤摘要】
硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用
本专利技术属于SSR分子标记
，具体涉及硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用。
技术介绍
硬叶兜兰(Paphiopedilummicranthum)兰科，兜兰属，地生或半附生植物。叶基生；数枚至多枚，叶片带形、革质。花葶从叶丛中长出，花苞片非叶状；子房顶端常收狭成喙状；花大而艳丽，有种种色泽；中萼直立，花粉粉质或带粘性，退化雄蕊扁平；柱头肥厚，下弯，柱头面有乳突，果实为蒴果。兜兰花比较雅致，色彩比较庄重，带有不规则斑点或条纹。花瓣较厚，花朵开放期比较长，具有较好的观赏价值。同时硬叶兜兰全草入药，味苦、性凉，具有清热解毒、补脑安神的功能，可用于麻疹、肺炎、神经衰弱的治疗中。近年来，硬叶兜兰研究主要开展了种群生态和空间遗传结构等研究，例如Li和Quiros采用RAPD分子标记对4个居群的遗传结构进行初步研究，表明硬叶兜兰在物种水平的遗传多样性高于居群水平，经分子方差分析有20.3％的遗传多样性来自于居群间的分化。SSR分子标记具有使用简便、快速、稳定性高、等位基因多样性高以及可做共显性的等位基因分析等特点，目前已成为一种主要的分子标记技术，被广泛应用于植物遗传分析及品种鉴定等多方面研究领域。目前还没有利用SSR分子标记分析硬叶兜兰等位基因多样性的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用，丰富这硬叶兜兰遗传研究的手段，为将来对硬叶兜兰进一步遗传分析和品种鉴定提供技术基础。本专利技术提供的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1～58所示的引物。本专利技术提供了所述硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组的开发方法，包括以下步骤：1)提取硬叶兜兰的基因组DNA；2)用限制性内切酶对步骤1)中所述基因组DNA进行酶切，所得酶切产物和MseI接头连接，得到连接产物；3)以步骤2)中所述连接产物为模板，用MseI-N引物预扩增，得到预扩增产物；所述MseI-N引物的核苷酸序列如SEQIDNo.59所示；4)将步骤3)中所述预扩增产物用探针组进行杂交，得到杂交产物；所述探针组包括(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针；5)将步骤4)中所述杂交产物经磁分离，纯化，得到纯化的DNA片段；6)将步骤5)中纯化的DNA片段用MseI-N引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物以重组载体的形式转入原核表达系统中，经诱导培养，筛选阳性克隆；7)对所述阳性克隆进行测序，对得到的阳性克隆的序列进行微卫星分析，按照筛选标准筛选得到SSR分子标记；8)以步骤7)中所述SSR分子标记为模板设计引物，筛选，得到硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组。优选的，步骤7)中所述筛选标准包括选择AC、AG和AAG中一种式样、所述式样连续分布和所述式样重复次数在6次以上。优选的，步骤7)中微卫星重复序列的位置应处于序列的中部，两端的非重复碱基数应该在20个以上。优选的，步骤3)和步骤6)中用MseI-N引物扩增的反应体系如下：优选的，步骤3)和步骤6)中用MseI-N引物扩增的反应程序如下：95℃，3min；94℃，30s；53℃，60s；35个循环；72℃，60s。优选的，所得酶切产物和MseI接头连接的反应体系：优选的，步骤2)中所得酶切产物和MseI接头连接的反应条件：37℃，2h；所述连接完成后，在65℃灭活10min。优选的，杂交时的反应体系如下：反应体系1：PCR产物30μL150～300pmol探针组1.5μL反应体系2：20×SSC52.5μL质量浓度10％SDS1.75μLddH2O164.25μL；杂交时的反应条件：95℃变性5min，48℃保温2h。本专利技术提供了所述的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组或所述的开发方法得到的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组在植物遗传分析或品种鉴定中的应用。本专利技术提供的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1～58所示的引物。所述29对引物经过试验验证能扩增出清晰稳定条带。经过微卫星开发试验挑选出了240个阳性克隆并进行测序，其中180个(75.0％)克隆含有微卫星序列；根据引物设计的原则，共设计并合成了102对引物。根据PCR扩增及筛选，共有29对引物成功扩增出清晰稳定的条带。本专利技术提供的引物组能大大丰富硬叶兜兰遗传研究的手段，为将来对硬叶兜兰进行进一步的遗传分析和品种鉴定的研究提供技术基础。附图说明图1为本专利技术利用H169SSR引物对鉴别三种兜兰DNA材料的电泳图。具体实施方式本专利技术提供的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1～58所示的引物。所述引物组的来源可以委托基因合成公司合成得到。所述引物组中各引物对的序列信息及退火温度见表1：本专利技术提供了所述硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组的开发方法，包括以下步骤：1)提取硬叶兜兰的基因组DNA；2)用限制性内切酶对步骤1)中所述基因组DNA进行酶切，所得酶切产物和MseI接头连接，得到连接产物；3)以步骤2)中所述连接产物为模板，用MseI-N引物预扩增，得到预扩增产物；所述MseI-N引物的核苷酸序列如SEQIDNo.59所示；4)将步骤3)中所述预扩增产物用探针组进行杂交，得到杂交产物；所述探针组包括(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针；5)将步骤4)中所述杂交产物经磁分离，纯化，得到纯化的DNA片段；6)将步骤5)中纯化的DNA片段用MseI-N引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物以重组载体的形式转入原核表达系统中，经诱导培养，筛选阳性克隆；7)对所述阳性克隆进行测序，对得到的阳性克隆的序列进行微卫星分析，按照筛选标准筛选得到SSR分子标记；8)以步骤7)中所述SSR分子标记为模板设计引物，筛选，得到硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组。本专利技术提取硬叶兜兰的基因组DNA。在本专利技术中，所述提取硬叶兜兰的基因组DNA的方法是在改良CTAB法的基础上，在加入4×CTAB裂解液之前，先加入去糖缓冲液进行抽提，将多糖和色素尽可能去除，最终得到质量较好的DNA。提取得到基因组DNA后，对所述DNA的浓度测定以及去除RNA。所述去除RNA的方法优选为采用RNA酶法降解。得到基因组DNA，本专利技术用限制性内切酶对步骤1)中所述基因组DNA进行酶切，所得酶切产物和MseI接头连接，得到连接产物。在本专利技术中，所述限制性内切酶优选为限制性内切酶-MseI。所述酶切的反应体系如下：所述酶切的反应条件：37℃，3h，酶切结束后，65℃，10min将内切酶灭活。酶解后，优选将得到的酶解产物进行电泳检测：1.5％琼脂糖，100V电泳20min，点样8μL，剩余15μL用于连接。在本专利技术中，所得酶切产物和MseI接头连接的反应体系优选如下：所得酶切产物和MseI接头连接的反应条件优选如下：37℃，2h；所述连接完成后，在65℃灭活10min。得到连接产物后，本专利技术以所述连接产物为模板，用MseI-N引物预扩增，得到预扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，其特征在于，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的H13正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的H13反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的H14正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示的H14反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示的H19正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示的H19反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示的H35正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示的H35反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示的H43正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示的H43反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.11所示的H48正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.12所示的H48反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.13所示的H51正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示的H51反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.15所示的H58正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.16所示的H58反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.17所示的H68正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.18所示的H68反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.19所示的H113正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.20所示的H113反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.21所示的H150正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.22所示的H150反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.23所示的H169正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.24所示的H169反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.25所示的H197正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.26所示的H197反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.27所示的H203正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.28所示的H203反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.29所示的H206正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.30所示的H206反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.31所示的H219正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.32所示的H219反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.33所示的H220正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.34所示的H220反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.35所示的H233正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.36所示的H233反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.37所示的H237正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.38所示的H237反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.39所示的H243正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.40所示的H243反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.41所示的H246正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.42所示的H246反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.43所示的H251正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.44所示的H251反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.45所示的H258正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.46所示的H258反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.47所示的H313正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.48所示的H313反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.49所示的H314正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.50所示的H314反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.51所示的H334正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.52所示的H334反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.53所示的H335正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.54所示的H335反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.55所示的H343正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.56所示的H343反向引物；和核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.57所示的H371正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.58所示的H371反向引物。...
【技术特征摘要】
1.硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，其特征在于，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示的H13正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示的H13反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示的H14正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示的H14反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.5所示的H19正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.6所示的H19反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示的H35正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.8所示的H35反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.9所示的H43正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.10所示的H43反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.11所示的H48正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.12所示的H48反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.13所示的H51正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.14所示的H51反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.15所示的H58正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.16所示的H58反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.17所示的H68正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.18所示的H68反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.19所示的H113正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.20所示的H113反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.21所示的H150正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.22所示的H150反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.23所示的H169正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.24所示的H169反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.25所示的H197正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.26所示的H197反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.27所示的H203正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.28所示的H203反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.29所示的H206正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.30所示的H206反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.31所示的H219正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.32所示的H219反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.33所示的H220正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.34所示的H220反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.35所示的H233正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.36所示的H233反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.37所示的H237正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.38所示的H237反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.39所示的H243正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.40所示的H243反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.41所示的H246正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.42所示的H246反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.43所示的H251正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.44所示的H251反向引物；核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.45所示的H258正向引物，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.46所示的H258反向引物；核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄家林，张石宝，胡虹，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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