本发明专利技术涉及一株假交替单胞菌属多糖降解菌及其培养方法与应用。一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)Q02，于2018年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.16720；该菌株能以微生物、海藻、陆地植物以及动物来源的多种类型的多糖为唯一碳源生长，所产多糖降解酶的种类丰富，是一株多能型多糖降解菌，用该菌株制备的胞外酶制剂可降解微生物、海藻、植物和动物多糖，尤其对来源于海藻的褐藻胶、琼脂糖以及来源于动物的HA、CSC、CSE降解活性显著。
【技术实现步骤摘要】
一株假交替单胞菌属多糖降解菌及其培养方法与应用
本专利技术涉及一株假交替单胞菌属多糖降解菌及其培养方法与应用，属于生物
技术介绍
多糖，是由重复的单一或不同糖单元通过糖苷键连接而成的聚合物。根据生物来源的不同，常见微生物多糖有肽聚糖、黄原胶等，海藻多糖如琼脂糖、褐藻胶、卡拉胶等，高等植物多糖如纤维素、甘露聚糖、木聚糖和淀粉等，以及动物多糖如糖胺聚糖、几丁质等[1]。这些多糖是生物体的重要成分，有些还是能源物质，部分是参与细胞识别的信息分子[2]。其中，包括透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素等在内的糖胺聚糖或寡糖，广泛分布于海洋动物和陆生动物组织的细胞表面或细胞外基质，参与了中枢神经系统发育[3-4]，组织形态发生[5]，信号传导[6-7]，细胞增殖分化[8-10]，伤口修复[11-12]，病毒侵染[13-15]等多种生理学和病理学行为，因此糖胺聚糖的研究具有重要意义。研究还表明，其它多糖及其降解产物也具有多种重要生理活性如：新琼寡糖具有抗氧化作用[16]、黄原胶具有优良的稳定性[17]、褐藻胶具有吸水成胶能力[18]等。综上，多糖及其寡糖产物具有重要的应用价值，因此多糖降解菌及其多糖降解酶资源的开发一直是酶法制备寡糖的研究热点之一，其中新型多糖降解菌的发现是研制新型工具酶的源头保障。多能型多糖降解菌是指能以多种多糖为唯一碳源进行生长的菌株[19-20]。一株多能型多糖降解菌可产生多种不同类型的多糖降解酶，催化底物分子中糖单元间糖苷键的断裂，产生一系列寡糖乃至单糖，从而实现菌株对不同多糖碳源的降解和利用，其突出特征即是一菌多能。因而，对新型多糖降解菌及其酶资源的开发具有重要价值和意义。海洋蕴含着大量的微生物资源，因此一直是生物资源开发领域的研究重点。目前，海洋来源的多能型多糖降解菌仅见国内Flammeovirgasp.MY04[21]、Persicobactersp.JZB09[22]、Pseudoalteromonassp.A601[23]、Vibriosp.FC509[24]及国外如Saccharophagusdegrada-ns[25-28]、Zobelliagalactanivorans[29]等少数菌株的报道。假交替单胞菌和弧菌被认为是海洋环境中细菌的代表性物种，它们数量大、种类多、分布广，其资源学和生态学的研究意义十分重要。2014年，专利技术人曾经筛选到一株弧菌Vibriosp.FC509[24]，它可产生多种多糖降解酶，因而既能降解海藻多糖又能降解动物多糖尤其能高效降解糖胺聚糖，如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素等。所产糖胺聚糖内切酶HCLase能高效降解透明质酸和多种类型硫酸软骨素[30]，硫酸酯酶可以通过内切模式脱去糖链上4位硫酸根[31]，糖胺聚糖外切酶HCDLase可以从寡糖还原端向非还原端逐渐产生二糖单元[32]，内切型软骨素裂解酶HCLaseEr是第一个被鉴定的不能作用于E单元的透明质酸/硫酸软骨素裂解酶[33]。在此基础上，综合利用来自同一菌株的这些多糖降解酶，可对复杂的CS寡糖进行测序，进而进行糖胺聚糖构效关系的研究，因此应用价值极其重要[34]。2017年，NicoleKing课题组发现费氏弧菌能够促进领鞭毛虫的交配繁殖，并证实费氏弧菌VibriofischeriATCC700601分泌的蛋白-Eros(透明质酸/糖胺聚糖裂解酶)能发挥“催情剂”的作用，从而导致了这一现象的产生，这表明弧菌可以诱导真核生物的有性生殖[35]。我们分析了NCBI网站公开的该费氏弧菌菌株的基因组，发现富含多糖降解酶基因，因此推测其是多能型多糖降解菌。这提示：多能型多糖降解菌有可能参与了众多跨物种的生殖过程，它们所产多糖降解酶具有重要的生理功能和生态学效应。Lee.S等[36]认为假交替单胞菌属细菌能够抑制藻类孢子萌发，或溶解藻类细胞，在维持生态环境的平衡过程中扮演了重要角色。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)是Gauthier等根据16SrRNA序列建立起来的区别于假单胞菌属(Pseudomonas)和交替单胞菌属(Alteromonas)的新属[37]，国内外学者已分离并鉴定出了多株假交替单胞菌[38-42]。相比之下，假交替单胞菌属来源的多能型多糖降解菌较少，仅见如Pseudoalteromonassp.A601的研究[23]。该菌株只能降解淀粉、琼脂糖等植物或海藻多糖，但是不能降解糖胺聚糖等动物多糖。那么，假交替单胞菌属是否存在能降解如透明质酸、硫酸软骨素等糖胺聚糖的菌株？这样的菌株是否也能参与真核生物的生理过程？目前未见相关菌株的发现与深入研究。已有研究表明，假交替单胞菌能产生胞外酶、胞外多糖、毒素等多种与致病性有关的物质，是一类条件致病菌。因此，对于假交替单胞菌的研究主要集中于病害防治和菌株药敏特性等方面，关于多糖降解酶的研究相对较少且集中于菌株所产单一多糖降解酶，如琼胶酶、β-半乳糖苷酶,α-淀粉酶和果胶裂解酶等[43-46]。然而，少见假交替单胞菌属的具有糖胺聚糖降解能力的多能型多糖降解菌。因此，对于这一重要海洋微生物物种的资源开发必然有利于相关分子致病机制的认知和功能寡糖药物的研制。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一株来源于海岸沉积物的能降解、利用多种不同类型多糖的假交替单胞菌及其培养方法与应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02，于2018年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.16720。假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02菌株，革兰氏染色阴性，该菌株在平板上形成圆形菌落，表面光滑，整体呈乳白色，同时可以发现到在菌落周围有较为明显的凹陷。用于菌体形态观察的固体培养基为初筛固体培养基，组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，固体平板加1.5％琼脂糖，余量人工海水(NaCl30g，KCl7.5g，CaCl21.1g，MgSO47.2g，NH4Cl1.5g，ddH2O1000mL，pH7.2)，pH7.2。假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02菌株，经测定，其16SrRNA的基因序列长度为1464bp，如SEQIDNO.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)BLASTN程序搜索比对，证明本专利技术的菌株的16SrRNA的基因序列与NCBI注册的假交替单胞菌标准菌株(Pseudoalteromonas)16SrRNA的基因序列具有较高的同源性，其中与标准菌株PseudoalteromonasmariniglutinosaDSM15203的最近，序列相似度为98.8％。假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02菌株，采用16SrRNA基因构建系统发育树，结果如图3所示。结果表明，Q02菌株与假交替单胞菌属的模式菌株聚类，且位于该分支内部。因此，将Q02菌株鉴定至假交替单胞菌属。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)Q02，于2018年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.16720。
【技术特征摘要】
1.一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02，于2018年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.16720。2.权利要求1所述假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将冷冻保存的假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02菌株样品，划线至初筛固体培养基上，25～30℃倒置培养18～48h，制得活化菌株；(2)挑取步骤(1)制得的活化菌株，接种至初筛液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，摇床培养16～24h，制得种子液；(3)将步骤(2)制得的种子液，按1～5％的体积百分比接种于扩大培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，扩大培养4～6天，制得假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02菌液。3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的初筛固体培养基，每升组分如下：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂15g，余量人工海水，pH7.2；上述人工海水组份如下：NaCl30g，KCl7.5g，CaCl21.1g，MgSO47.2g，NH4Cl1.5g，ddH2O定容至1000mL；优选的，所述步骤(2)中的初筛液体培养基，每升组分如下：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g，余量人工海水，pH7.2；上述人工海水组份如下：NaCl30g，KCl7.5g，CaCl21.1g，MgSO47.2g，NH4Cl1.5g，ddH2O定容至1000mL；优选的，所述步骤(3)中的扩大培养基，每升组分如下：蛋白胨4g，酵母提取物2.5g，余量人工海水；上述人工海水组份如下：NaCl30g，KCl7.5g，CaCl21.1g，MgSO47.2g，NH4Cl1.5g，ddH2O定容至1000mL。4.权利要求1所述假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q02菌株在制备降解海藻多糖酶制剂中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：(i)取上述假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)Q0...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩文君，王延辉，李俊鸽，单宁宁，胡玮，冯璋，王一兵，李福川，古静燕，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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