鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法，基于驴的CYT B和COX‑1基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物，使用上述引物可用于阿胶中驴源性成分进行鉴定，能将驴与其他混淆品准确的分开，且其PCR扩增产物仅为70～120bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的阿胶中驴源性成分鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法
本专利技术属于中药材鉴定
，具体涉及一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。
技术介绍
阿胶(ASINICORIICOLLA)为马科动物驴(EquusasinmL.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩，并可加入适量的黄酒、冰糖及豆油制成的固体胶，具有补血滋阴，润燥，止血的功效，用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、肌痿无力和心烦不眠等症状。阿胶为《中国药典》2015版的收录品种，其药用历史悠久，始载于《神农本草经》，被列为“上品”，称其“可久服轻身益气”，是药食同源的重要物种，尤其在治未病方面功效显著。关于阿胶的医方医案有3200多个，其中包括200多个膏方和200多个食疗方。现代研究表明阿胶能调节身体机能，增强免疫力，在肿瘤辅助治疗、血液病等重大疾病防治上，其治疗优势也正逐步凸显。我国药典明确规定生产阿胶的原料是驴皮。然而，我国驴养殖业发展严重滞后，驴的存栏数呈逐年下滑之势。以致近年制胶原料驴皮短缺、原料价格上涨，造成目前阿胶市场混乱，掺杂使假情况屡屡发生，主要掺假成分包括猪皮、牛皮、马皮甚至皮革下脚料等，给大众用药安全带来重大隐患，因此，建立有效的阿胶质量控制方法是当前急需解决的问题。传统的阿胶真伪鉴别方法，采用通过产品的外观、颜色和气味等实现，需要极为丰富的个人经验和深厚的专业知识，而各种杂皮胶的制备工艺与正品相似，故其外观性状极为相近，更大大增加了鉴别的难度。中国专利文献CN105586420A中公开了一种准确鉴别阿胶原料驴源性成分的特异性引物对及其方法，通过DNA提取、PCR特异性扩增、酶切、电泳检测可以鉴别阿胶原料即驴皮中是否存在驴源性成分。中国专利文献CN106636385A公开了一种用于驴源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，通过DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测可以鉴别肉食原料是否存在驴源性成分。以上两个专利文献均是对驴的直接产品(驴皮或驴肉)进行鉴定，难度相对较低，直接提取即可得到高质量DNA，然而阿胶为深加工产品，在阿胶的生产过程中，驴皮经高温长时间煎煮，DNA遭到严重破坏，成品中DNA含量少而且片段极短，而且，阿胶成品中主要成分为各种胶原蛋白肽段，大量蛋白的存在会严重影响DNA提取的效率。此外，制备阿胶成品的过程中，不仅要经过长时间煎煮，而且后期要加入黄酒、豆油等辅料，这些辅料的加入会加大提取成品阿胶DNA的难度并引入多种抑制PCR反应的成分，以上原因使得阿胶中驴源性成分的鉴别难度很大，使用上述现有技术的方法鉴定阿胶中驴源性成分时，易出现扩增困难，出现杂带等问题，准确度、灵敏度低，特异性差，均不适用于对阿胶的鉴别。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题在于提供一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，采用所述引物鉴定阿胶中驴源性成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量阿胶中驴源性成分进行快速鉴定，效率高。本专利技术要解决的第二个技术问题在于提供一种鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，采用所述试剂盒鉴定阿胶中驴源性成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量阿胶中驴源性成分进行快速鉴定，效率高。本专利技术要解决的第三个技术问题在于提供一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，采用所述方法鉴定阿胶中驴源性成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量阿胶中驴源性成分进行快速鉴定，效率高。为此，本专利技术提供了一种用于鉴定阿胶中驴源性成分的引物，所述引物如下：上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。本专利技术还提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，含有所述的引物。优选的，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及无菌超纯水。所述的引物或所述的试剂盒在鉴定产品中驴源性成分中的应用；所述产品包括但不限于驴皮、阿胶半成品、阿胶成品、含阿胶的药物组合物或含阿胶的药物制剂。本专利技术还提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，包括如下步骤：(1)对待测样品进行预处理，得到预处理样品；(2)提取预处理样品中的总DNA，备用；(3)以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′；(4)测定步骤(3)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有70～120bp的DNA片段，则所述待测样品中存在驴源性成分；反之，则所述待测样品中不存在驴源性成分。进一步的，所述待测样品预处理方法为透析预处理；优选的，所透析预处理的具体步骤为：取待测样品，加适量水，温浴烊化，得样品溶液，将样品溶液置于分子量为1～2kd的透析袋中，然后使用适量水作为透析介质对样品溶液进行透析，收集合并透析液，40～85℃的范围内浓缩蒸干，即得预处理样品。优选的，所述样品溶液制备中，所述待测样品与水的用量比为：3～4重量份：30～50体积份；所述重量份和体积份的比值关系为g/ml；优选的，所述透析过程中，重复透析2～3次，每次3～12小时；优选的，所述透析袋内部的样品溶液与透析袋外部的透析介质的体积比为30～50：700～900。进一步的，在步骤(3)中，所述PCR反应体系包括：DNA模板，20～40ng/μL，1～5μL；上游引物，10μM，0.5～1.5μL；下游引物，10μM，0.5～1.5μL；TaqDNA聚合酶，5U/μL，0.2～1.2μL；dNTPs，10mM，0.25～1μL；10×PCR扩增缓冲液，1.5～4.5μL；无菌超纯水补至25μL；优选的，所述PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；然后继续72℃延伸5～10min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。进一步的，所述步骤(4)中，所述70～120bp的DNA片段为80bp的DNA片段。优选的，所述的80bp的DNA片段序列如SEQIDNO：7所示。本专利技术技术方案，具有如下优点：(1)本专利技术所述的鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，基于驴的CYTB和COX-1基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物对，使用上述引物对不仅能够用于简单加工的驴皮、长时间煮沸得到的阿胶半成品，尤其适用于深加工的阿胶产品以及含有阿胶产品的药物组合物和药物制剂中驴源性成分进行鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，并能将驴源性成分与其他亲源关系比较近的种属混淆品准确的分开，特异性高，且其PCR扩增产物仅为70～120bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的阿胶中驴源性成分鉴定。(2)本专利技术所述的鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的用于鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，所述引物具有种属特异性，使用上述引物对能够对深加工的阿胶产品以及含有阿胶产品的药物中驴源性成分进行鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，其特征在于，所述引物如下：上游引物：5′‑CCCCATCATTCCTACTTCTTCT‑3′；下游引物：5′‑TAGGGGAGGATATACGGTTCAG‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，其特征在于，所述引物如下：上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。2.一种鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及无菌超纯水。4.一种如权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定产品中驴源性成分中的应用；所述产品包括但不限于驴皮、阿胶半成品、阿胶成品、含阿胶的药物组合物或含阿胶的药物制剂。5.一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对待测样品进行预处理，得到预处理样品；(2)提取预处理样品中的总DNA，备用；(3)以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′；(4)测定步骤(3)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有70～120bp的DNA片段，则所述待测样品中存在驴源性成分；反之，则所述待测样品中不存在驴源性成分。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样品预处理方法为透析预处理；优选的，所透析预处理的具体步骤为：取待测样...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚璐，魏弘宜，赵晨，彭鹏，
申请(专利权)人：北京同仁堂科技发展股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11