一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，包括灌流液配制步骤、乳鼠主动脉逆行灌流步骤、心肌组织的分离步骤；其特征在于通过针头的连接使得胶原酶液持续地经主动脉‑冠脉系统充分灌流至心肌组织。本发明专利技术将胶原酶液经主动脉‑冠脉系统灌流至心肌组织，相较于大多科研人员所采用组织‑酶消化法来分离大鼠乳鼠心肌细胞，本法所获得的心肌细胞存活率高，细胞状态好，分离后不仅能进行原代心肌细胞培养，还能即刻进行膜片钳、单细胞染色和共聚焦显微镜成像、活细胞工作站动态观察与参数分析等后续实验操作，而传统的组织‑酶消化法若进行上述膜片钳等实验操作需将分离获得的细胞纯化和培养48小时以上心肌细胞恢复其原有形态后方可进行。

【技术实现步骤摘要】
一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法
本专利技术属于心脏病学研究的应用
，具体涉及一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法。
技术介绍
目前，大鼠心肌细胞的分离方法可以分为机械收集法、Langendorff离体灌流法和组织-酶消化法，其中目前Langendorff离体灌流法较为常用，且主要应用于成年大鼠的心肌细胞分离。相较于另外两种方法，Langendorff离体灌流法急性分离成年大鼠心肌细胞，能提高心肌细胞分离后的存活率，细胞状态稳定、功能良好，且急性分离获得的细胞更接近活体的生理状态，实验结果更具说服力。大鼠乳鼠指出生后0-7天的大鼠，其心脏体积较小，目前欲对乳鼠心肌细胞分离多采用组织-酶消化法，即：将大鼠乳鼠的心脏取出、漂洗后，用眼科剪剪成约1mm3的小组织块，加入胰蛋白酶液或胶原酶液或混合酶液后，温箱或水浴锅中孵育、消化一定时间后，吸取上清液，所取上清液中反复用巴氏吸管吹打使其中细胞充分吹散、无细胞团块后加入终止液，终止消化后即可在显微镜下观察到圆形心肌细胞(如图1-1所示，组织块-酶消化法分离得到的丧失原有形态的心肌细胞和细胞团(球状，如箭头所指)和成纤维细胞；如图2所示，组织块-酶消化法分离得到的心肌细胞(圆形)和成纤维细胞，必须再经过培养方可恢复形态)。组织块-酶消化后也可用差速贴壁法分离纯化和离心新生鼠细胞，以获得更高浓度的细胞悬液，此法需重复操作多次，步骤繁琐，所需时间较长，会增加细胞的死亡和降低获取的细胞浓度，由于细胞分离完成后，心肌细胞丧失了原有的杆状形态，若要进行膜片钳测定细胞离子通道状态或活细胞工作站观察细胞功能需将细胞进行48-72小时培养，整体时间较长。现阶段Langendorff装置离体灌流主要应用于成年大鼠的心肌细胞分离，且技术逐渐成熟，在肉眼直视下将针头插入成年大鼠主动脉近心端并进行灌流、酶消化后，可获得大量的心肌细胞，且可于梯度复钙、贴壁后直接用于膜片钳、共聚焦显微镜等后续实验。但尚未见有文献报道将Langendorff灌流应用于乳鼠心肌细胞的分离。本专利技术将Langendorff离体灌流操作技术应用于大鼠乳鼠心肌细胞的分离，所获得的心肌细胞的形态学和功能状态优于机械收集法和组织-酶消化法。但是，本法分离乳鼠心肌细胞时，要求心脏在离体后2min之内完成插管并开始灌流，对于实验者的操作技术要求更高，且常需要在他人的协助下完成。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，将大鼠乳鼠的心脏急性分离为含单个心肌细胞的细胞悬液，所获得的心肌细胞存活率高，细胞状态好，分离后即能进行膜片钳、单细胞染色的共聚焦显微镜成像、活细胞工作站动态观察与分析等后续实验操作。本专利技术为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，包括灌流液配制步骤、乳鼠主动脉逆行灌流步骤、心肌组织的分离步骤；其特征在于通过针头的连接使得胶原酶液经主动脉-冠脉系统充分灌流至心肌组织，且灌流液体流速均匀、持续也不超过2mL/min。按上述方案，所述心脏灌流液(标记为Ⅰ液)为Krebs-Ringer(KR)液或PBS、Krebs-Henseleit(KH)液、Hanks液、无钙台氏液等平衡盐溶液。若使用KR作为Ⅰ液，各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠35±0.5，氯化钾4.75±0.05，磷酸二氢钾1.19±0.03，磷酸氢二钠16±0.3，蔗糖134±1，碳酸氢钠25±2.5，葡萄糖10±2，HEPES10±1，并用氢氧化钠将Ⅰ液的pH调至7.4±0.2。亦可选用KH液、PBS液、Hanks液、无钙台氏液作为Ⅰ液。KH液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠118±0.5，氯化钾4.7±0.05，磷酸二氢钾1.19±0.03，碳酸氢钠25±2.5，葡萄糖10±2，并用氢氧化钠将Ⅰ液的pH调至7.4±0.2。PBS液各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠137±0.5，氯化钾2.7±0.05，磷酸氢二钠10±2，磷酸二氢钾1.8±0.3，并用氢氧化钠将Ⅰ液的pH调至7.4±0.2。Hanks液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钾5.4±0.1，磷酸二氢钾0.44±0.01，氯化钠137±0.5，磷酸氢二钠0.34±0.01，葡萄糖5.5±1，碳酸氢钠4.2±0.2，并用氢氧化钠将Ⅰ液的pH调至7.4±0.2。根据后续实验情况，取50-500mlⅠ液预冷、备用；并将余下的Ⅰ液预充95％O2+5％CO2，根据实验室环境温度预热至37-39℃，备用。按上述方案，消化酶解后的心肌细胞保存液(标记为Ⅳ液)为KB液或Hanks液、无钙台氏液、KH液。若使用KB液作为所述Ⅳ液，Ⅳ液各组分浓度按照mmol/L计为：牛磺酸10±0.1，谷氨酸70±1，氯化钾25±0.25，磷酸二氢钾10±0.5，葡萄糖22±1，并用氢氧化钾将KB液的pH调至7.2±0.05。将配制好的Ⅳ液置0-4℃中储存或预冷，备用。按上述方案，所述胶原酶液(标记为Ⅱ液)是以上述Ⅰ液为分散液，按0.2-1mg/mLCollagenaseII或CollagenaseI(Worthington,USA或Sigma-Aldrich,USA)胶原酶的浓度配制的胶原酶液。该胶原酶液预充95％O2+5％CO2，根据实验室环境温度将胶原酶液预热至37-39℃，备用。按上述方案，心肌组织的分离步骤中的消化酶解终止液(标记为Ⅲ液)是以Ⅳ为分散液，按0.1-1mmol/L的EGTA或EDTA浓度，或按0.2-2mg/ml的BSA浓度配制的酶解终止液(实际操作过程中，可用Ⅲ液代替Ⅳ液)。按上述方案，主动脉逆行灌流所用器械主要包括10-50ml注射器、20-26g注射器平口钝针头、显微持针钳和体视显微镜等。按上述方案，主动脉逆行灌流操作过程，具体如下：1.提取大鼠乳鼠的心脏：根据大鼠乳鼠的身体状态等具体情况，按100-300U/只的剂量腹腔注射普通肝素或低分子量肝素钠、麻醉后，剪开心前区皮肤和肋骨，游离肺和其他组织，暴露心脏；然后，在主动脉根部上方2-3mm处剪断主动脉，夹持乳鼠主动脉残端取出心脏；2.将心脏用镊子夹持至已预冷并装有Ⅰ液的培养皿中冲洗，剪去多余的组织，在体视显微镜下找到主动脉断端口；装有Ⅰ液的10-50ml注射器针筒与20-26g平口钝针头或自制针头连接，然后将该针头缓慢插入主动脉内1-4mm，勿将针头插入过深而进入主动脉瓣和心室腔内，以免灌流时灌流液灌入心室腔而不能有效灌注心脏冠脉；接着用显微持针钳夹持主动脉将针头固定在主动脉内，按不超过2mL/min的速度匀速、持续推注Ⅰ液，使Ⅰ液经主动脉内的冠状动脉口有效灌注冠状动脉；灌注Ⅰ液不超过7min，使乳鼠心脏呈半透明状、心脏内血管无残血和血栓，用显微持针钳夹持针头固定在主动脉残端内，拔出针筒，连接装有Ⅱ液的针筒，按不超过2mL/min匀速、持续推注预热的Ⅱ液4-20min，拔出针头，即完成主动脉逆行灌流操作。按上述方案，心肌组织的分离步骤，具体过程如下：将上述完成主动脉逆行灌流操作的乳鼠心脏夹持入1-10mL预冷Ⅲ液的小烧杯中，用眼科剪将心脏剪碎至约1mm3的组织块，用巴氏吸管在Ⅲ液中反复吹打，直至液体呈浑浊悬液；静置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于它包括灌流液配制步骤、乳鼠主动脉逆行灌流步骤、心肌组织的分离步骤；其特征在于通过针头的连接使得胶原酶液经主动脉‑冠脉系统充分灌流至心肌组织，且灌流液体流速均匀、持续且不超过2mL/min。

【技术特征摘要】
1.一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于它包括灌流液配制步骤、乳鼠主动脉逆行灌流步骤、心肌组织的分离步骤；其特征在于通过针头的连接使得胶原酶液经主动脉-冠脉系统充分灌流至心肌组织，且灌流液体流速均匀、持续且不超过2mL/min。2.根据权利要求1所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于所述灌流液体为KR液或PBS、KH液、Hanks液、无钙台氏液中的一种；所述胶原酶液是以灌流液体为分散液，按0.2-1mg/mLCollagenaseⅡ或CollagenaseⅠ胶原酶的浓度配制的胶原酶液；所述心肌组织的分离步骤中的消化酶解后的心肌细胞保存液为KB液或Hanks液、无钙台氏液、KH液中的一种；所述心肌组织的分离步骤中的消化酶解终止液是以心肌细胞保存液为分散液，按0.1-1mmol/L的EGTA或EDTA浓度，或按0.2-2mg/ml的BSA浓度配制的酶解终止液。3.根据权利要求1所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于针头选择20-26g的平口钝头针头；或者选取20-26g的注射器针头，留取1-3cm针体将针头剪断，将针头断端磨平即可。4.根据权利要求2所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于所述KR液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠35±0.5，氯化钾4.75±0.05，磷酸二氢钾1.19±0.03，磷酸氢二钠16±0.3，蔗糖134±1，碳酸氢钠25±2.5，葡萄糖10±2，HEPES10±1，并用氢氧化钠将KR液的pH调至7.4±0.2；所述KH液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠118±0.5，氯化钾4.7±0.05，磷酸二氢钾1.19±0.03，碳酸氢钠25±2.5，葡萄糖10±2，并用氢氧化钠将KH液的pH调至7.4±0.2；所述PBS液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠137±0.5，氯化钾2.7±0.05，磷酸氢二钠10±2，磷酸二氢钾1.8±0.3，并用氢氧化钠将PBS液的pH调至...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，范稣圳，
申请(专利权)人：武汉大学人民医院湖北省人民医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42